酵母双杂交技术筛选研究乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP结合蛋白
陈国凤
王琳
成军
张玲霞
李莉
张健
邵清
纪冬
1.解放军军医进修学院,北京,1008532.解放军军医进修学院,北京,1008533.解放军军医进修学院,北京,1008534.解放军军医进修学院,北京,1008535.解放军军医进修学院,北京,1008536.解放军军医进修学院,北京,1008537.解放军军医进修学院,北京,1008538.解放军军医进修学院,北京,100853
摘要：目的筛选与乙型肝炎病毒DNA聚合酶-N末端蛋白(TP)相互结合的肝细胞蛋白,进一步探讨TP的生物学功能.方法酵母双杂交相关实验材料购自美国Clontech公司,其中pACT2为人肝配合表达的cDNA文库(HumanLiver MATCHMAKER cDNA Library),产品号为HLA024AH.pGBKT7-53和pGADT7-T中的p53和大T抗原在酵母双杂交试验中相互作用,为阳性对照,pGBKT7-Lam中的Lamin C既不与其他蛋白形成复合物又不与大多数蛋白发生反应,为阴性对照.含有AF384372 HBV DNA P全基因组cDNA的质粒G318A7由解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心合成并保存.TP基因的上下游引物序列分别为:5'-GAA TTC ATG ATG CCC CTA TCT TAT CAA-3′,5′-GGA TCCTTA CTC TTG TTC CCA AGA ATA-3′,下划线部分为引物两端内切酶EcoRI和BamHI的酶切位点.引物合成及DNA测序由上海博亚公司完成.用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP片段,连接人酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,用醋酸锂法转入酵母细胞AH109并在其内表达,挑取在SD/-Trp培养基上的转化子-即pGBKT7-TP(AH109)(计数大于1×109个细胞/ml),与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187配合,生长6～18 d后把长出的＞2 mm的酵母集落,在铺有X-α-gal的QDO培养基上检查α-gal活性,蓝色菌落为真阳性集落.挑取阳性集落提取酵母质粒,以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠埃希菌,于含有氨苄西林的SOB平板培养,所获得的菌落酶切鉴定后测序.提交GenBank分析.结果成功得到47个与TP特异性结合的阳性克隆,28个克隆与已知基因的部分序列高度同源(96%～100%),含21种目的基因,其余19个克隆基因为假设蛋白(hypothetical pro-tein).筛选出的目的基因包括有:固醇调节元件结合蛋白1;UDP糖基转移酶1家族多肽A9;CD14抗原;β糖蛋白血液结合素;Ⅰ类乙醇脱氢酶γ多肽;WW域结合蛋白2;醛脱氢酶1;延伸因子2;S蛋白基因;补体成分8,α多肽(C8A);唾液酸糖蛋白受体2,转录变异体3;肉毒碱酰基转移酶,转录变异体3;血浆铜蓝蛋白(CP);β激活素E亚基;Z蛋白依赖性蛋白酶抑制剂前体;前列腺特异性膜抗原基因;11号染色体,克隆RP11-107P7;RNA聚合酶Ⅱ亚单位hsRPB7 mRNA;跨膜蛋白4超家族成员2;跨膜蛋白14 A;铁蛋白L链.19个假设蛋白的同源性在97%～100%.结论TP蛋白可以与肝细胞内某些已知和未知功能蛋白相互结合,提示其具有较广泛的生物学功能.
关键词：乙型肝炎病毒DNA聚合酶酵母
分类号：R5(内科学)
资助基金：中国科学院资助项目(C03011402;C30070689)军队科技攻关项目(98D063)军队科研项目(98H038)军队科技攻关项目(01Q138)军队科技攻关项目(01MB135)
论文发表日期：2005-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：1( 22 )
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