利用双萤光素酶报告基因系统筛选有效的siRNA
单志新
林秋雄
谭虹虹
邓春玉
刘晓颖
肖定璋
余细勇
1.广东省人民医院医学研究中心/广东省心血管病研究所,广东,广州,5100802.广东省人民医院医学研究中心/广东省心血管病研究所,广东,广州,5100803.广东省人民医院医学研究中心/广东省心血管病研究所,广东,广州,5100804.广东省人民医院医学研究中心/广东省心血管病研究所,广东,广州,5100805.广东省人民医院医学研究中心/广东省心血管病研究所,广东,广州,5100806.广东省人民医院医学研究中心/广东省心血管病研究所,广东,广州,5100807.广东省人民医院医学研究中心/广东省心血管病研究所,广东,广州,510080
摘要：目的 建立一种利用双萤光素酶报告基因系统筛选能有效抑制目的 基因表达的小干扰RNA(siRNA)的方法.方法 以绿色荧光蛋白(GFP)基因为研究对象,构建3个候选的靶向GFP的siRNA表达质粒pSi-GFPsiRNA1、pSi-GFPsiRNA2、pSi-GFPsiRNA3和阴性对照pSi-Negative.构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子ATG的GFP与萤光素酶基因(LUC)的融合表达载体pGL3-GFPf.将包含3个GFPsiRNA靶序列的GFP片段插入到改建过的pGL3-promoter载体上LUC的3非翻译区(UTR),构建pGL3-GFPp.将GFP siRNA表达质粒联同内参照质粒pRL-TK分别与pGL3-GFPf、pGL3-GFPp共转化HEK293细胞.利用双萤光素酶检测试剂盒测定各组细胞中萤光素酶的活力水平,用荧光定量PCR检测各组细胞中GFP mRNA的表达水平.结果 同对照组相比,与pGL3-GFPf共转化GFP siRNA 表达质粒的各组细胞中萤火虫萤光素酶/海肾萤光素酶比值明显降低,其中GFPsiRNAl表达组中降低最显著(P<0.01);定量PCR检测也显示,GFPsiRNA1表达组中GFP mRNA的表达水平降低最明显(19<0.01).双萤光素酶活性检测和定量PCR结果还显示,与pGL3-GFPp共转化GFP siRNA表达质粒的各组细胞中,GFPsiRNA1抑制GFP的表达最显著(P<0.01).结论 本文建立了通过双萤光素酶活性检测来筛选有效的siRNA的方法,并为进行多个基因的有效siRNA的筛选提供解决方案.
关键词：双萤光素酶报告基因系统RNA干扰荧光定量PCR绿色荧光蛋白
分类号：Q78(基因工程（遗传工程）)
资助基金：国家自然科学基金(30300421)国家自然科学基金(30672077)广东省自然科学基金(06020831)
论文发表日期：2009-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：6( 1577-1581,1584 )
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