抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选
韩东刚1
段小艺2
郭佑民3
周琦1
王全颖4
杨广笑4
1.西安交通大学医学院第二附属医院,超声研究室,陕西西安7100042.西安交通大学医学院第一附属医院核医学科,陕西西安,7100613.西安交通大学医学院第二附属医院,影像中心,陕西西安7100044.西安华广生物工程公司,陕西西安,710025
摘要：目的 构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)特异性单链抗体库,从中筛选抗EGFRvⅢ特异性单链抗体.方法 用pep-3偶联载体蛋白OVA,然后免疫BALB/c小鼠从脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增莺链(VH)和轻链(VL)的可变区基因片段.将两基因片段由编码(Gly4Ser)3的linker连在一起,并克隆人噬菌体展示表达载体pCANTAB5E中,电转化至E. Coli TG1,经辅助噬菌体超感染,构建噬菌体单链抗体库.以pep-3-BSA为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,用ELISA鉴定抗体与EGFRvⅢ结合的特异性.结果 经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350和320 bp,与预期理论值相符.经重组PCR得到大小约780 bp的ScFv基因片段.ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为5.0×10~6的噬菌体抗体库,噬菌体滴度为3.0×10~4pfu/ml.通过亲和筛选使抗EGFRvⅢ噬菌体单链抗体得到富集,第4轮为第1轮的56倍.在E. Coli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达.SDS-PAGE结果显示抗体相对分子质量为28 000左右.ELISA测定结果显示该单链抗体具有结合EGFRvⅢ的特异性.结论 成功构建了噬菌体单链抗体库,筛选得到了抗EGFRvⅢ特异性噬菌体单链抗体.
关键词：噬菌体展示技术单链抗体表皮生长因子受体Ⅲ型突变体筛选
分类号：R742.3(神经病学与精神病学)
资助基金：国家自然科学基金(30600744)陕西省科技攻关计划(2007K11-02)
论文发表日期：2010-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：5( 25-29 )
英文信息