Has-mir-335慢病毒表达载体的构建及其靶基因鉴定
杨慧1
张超1
陆滟霞1
吴小金1
袁理2
周畅2
周春平2
刘国炳2
李学农1
1.南方医科大学 病理学系 广东省分子肿瘤病理学重点实验室,广东广州,5105152.南方医科大学 南方医院妇产科,广东广州,510515
摘要：目的 构建过表达miR-335的稳定细胞株SW620并筛选和初步鉴定miR-335的靶基因.方法 扩增包含hsa-miR-335前体序列在内的基因片段,并将其亚克隆至PLVTHM慢病毒载体；扩增包含RASA1 3’UTR种子区域的基因片段并将其亚克隆至psiCHECK-2载体,并对此重组载体进行定点突变构建psiCHECK-2-RASA1-Mut;检测萤火虫荧光素值(F)和海肾荧光素值(R),以R/F表示相对荧光素酶活性.流式细胞仪筛选建立稳定表达miR-335的细胞株,利用荧光定量PCR检测miR-335及其靶基因RASA1的表达,Western Blot检测RASA1蛋白水平的表达.结果 质粒双酶切以及测序鉴定PLVTHM-miR335、psiCHECK-2-RASA1、psiCHECK-2-RASA1-Mut重组质粒构建成功.荧光定量PCR显示结直肠癌细胞中miR-335与RASA1表达趋势成负相关.双荧光素酶报告基因分析证实hsa-miR-335能够作用于RASA1的31UTR.稳定过表达miR-335的细胞中,miR-335的表达明显高于对照组和未处理组,蛋白质水平有所下降.结论 成功构建了PLVTHM-miR-335慢病毒重组质粒,构建过表达miR-335的细胞株SW620,初步证实RASA1是miR-335的靶基因.
关键词：Has-mir-335慢病毒结直肠癌细胞双荧光素酶报告基因
分类号：R34(基础医学)
资助基金：国家自然科学基金(30871156)广东省科技计划(2009B030803041,2010B031600091)广东省自然科学基金(8151051501000057)
论文发表日期：2012-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：6( 306-311 )
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