shRNA-PAX6慢病毒载体构建及其对胶质瘤U251细胞增殖的影响
廖晓红
尹蔚兰
王芳
邬力祥
黄柏胜
1.中南大学湘雅医学院生理学系,湖南 长沙,4100782.中南大学湘雅医学院生理学系,湖南 长沙,4100783.中南大学湘雅医学院生理学系,湖南 长沙,4100784.中南大学湘雅医学院生理学系,湖南 长沙,4100785.中南大学湘雅医学院生理学系,湖南 长沙,410078
摘要：目的 构建shRNA-PAX6慢病毒载体并观察其对胶质瘤U251细胞增殖的影响.方法 根据文献报道的PAX6靶点序列,设计两条PAX6基因的siRNA靶点干扰序列,引物退火形成带粘性末端的双链,与经BamH I、EcoR I双酶切后线性化的慢病毒载体进行连接、转化,构建shRNA-PAX6慢病毒重组载体,再经菌落PCR及测序鉴定重组载体;在293T细胞中包装病毒,将包装后的shRNA-PAX6慢病毒重组载体感染U251细胞.Real-time PCR检测PAX6 mRNA的表达水平,Western blot检测PAX6蛋白的表达,MTT法检测U251细胞增殖.结果 慢病毒载体pLKD-CMV-G&NR-U6-shRNA经双酶切后可见线性化的8208 bp大片段,菌落PCR及测序鉴定证实shRNA-PAX6慢病毒重组载体构建成功,构建的shRNA-PAX6慢病毒载体在293T细胞完成包装,测得慢病毒滴度为6.73×108TU/mL;Real-time PCR结果显示,沉默PAX6的表达可见U251细胞PAX6 mRNA表达水平明显低于正常对照组及慢病毒空载体组(P<0.05);Western blot结果显示,PAX6蛋白表达亦明显低于正常对照组及慢病毒空载体组(P<0.05);MTT结果显示,与正常对照组及慢病毒空载体组细胞比较,感染shRNA-PAX6慢病毒重组载体组的细胞,细胞增殖能力明显增强(P<0.05).结论 成功构建人PAX6基因的shRNA-PAX6慢病毒重组载体,沉默PAX6基因的表达,U251细胞的增殖能力增强.
关键词：PAX6基因胶质瘤细胞细胞增殖RNA干扰慢病毒载体
资助基金：国家自然科学基金(81472160)湖南省自然科学基金(2015JJ2157)Supported by National Natural Science Foundation of China(81472160)
论文发表日期：2017-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：6( 1603-1608 )
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