利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株
周燕霞
胡韦维
张虹洋
邹琳
张鹏辉
1.重庆医科大学附属儿童医院临检中心//儿童发育疾病教育部重点实验室//儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地//认知发育与学习记忆障碍转化医学重庆市重点实验室,重庆,4000142.重庆医科大学附属儿童医院临检中心//儿童发育疾病教育部重点实验室//儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地//认知发育与学习记忆障碍转化医学重庆市重点实验室,重庆,4000143.重庆医科大学附属儿童医院临检中心//儿童发育疾病教育部重点实验室//儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地//认知发育与学习记忆障碍转化医学重庆市重点实验室,重庆,4000144.重庆医科大学附属儿童医院临检中心//儿童发育疾病教育部重点实验室//儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地//认知发育与学习记忆障碍转化医学重庆市重点实验室,重庆,4000145.重庆医科大学附属儿童医院临检中心//儿童发育疾病教育部重点实验室//儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地//认知发育与学习记忆障碍转化医学重庆市重点实验室,重庆,400014
摘要：目的 利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T细胞,为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型.方法 针对G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点靶向设计4对向导RNA(sgRNA),构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1(T7E1)酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变.结果 成功构建基于G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的Cas9-sgRNA外源PX458质粒,T7E1酶切检测四对sgRNA的编辑效率分别为6.74％、12.36％、12.54％、2.94％.测序鉴定敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生素K3诱导细胞死亡增加.结论 本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞模型,为后期研究基因的修复奠定了基础.
关键词：G6PDCRISPR/Cas9基因敲除HEK293T细胞
资助基金：重庆市社会民生科技创新专项(Cstc2016shmszx130032)
论文发表日期：2019-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：8( 320-327 )
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