大肠杆菌O157:H7体内多聚磷酸盐的DAPI荧光定量检测
杜艳丽1
韩宗利2
王湘雨3
万成松4
1.深圳职业技术学院医护学院,广东 深圳,5180362.北京大学深圳医院神经外科,广东 深圳,5180363.南方医科大学公共卫生学院 BSL-3 实验室,广东 广州 510515;深圳大学第一附属医院,深圳市第二人民医院消化内科,广东 深圳 5180364.南方医科大学公共卫生学院 BSL-3 实验室,广东 广州,510515
摘要：目的 应用荧光剂DAPI探索一种直接定量大肠杆菌O157:H7无机多聚磷酸盐(polyP)的可靠方法.方法 提取并纯化大肠杆菌O157:H7野生株DNA,DAPI与DNA、polyP45结合,测定360 nm和415 nm激发光的发射光谱;应用共聚焦显微镜,观察细菌DAPI-DNA和DAPI-polyP复合物荧光,验证DAPI检测polyP的可行性;细菌液氮速冻溶解、-80℃速冻溶解、-20℃速冻溶解、60℃加热10 min、Triton x-100作用、室温下放置后倍比稀释涂平板,观察6种方法对细菌存活的影响;与DAPI作用后,测定荧光值,确定细胞膜通透性的最佳前处理方法;建立标准曲线,测定EHEC野生株、ppk1两个突变株polyP含量.结果 应用360 nm激发波长,DAPI-DNA最大发射波长为460 nm;应用415 nm激发波长,DAPI-polyP最大发射波长为550 nm;应用405 nm激发光,收集DAPI-DNA蓝色荧光(425～475 nm),应用488 nm激发光,收集DAPI-polyP绿色荧光(500～560 nm);最佳细菌前处理方法为-80℃速冻后室温下自然溶解;标准曲线为Y=1849X+127.5(R2=0.991),测定各株菌polyP量,其中野生株显著高于ppk1缺失突变株.结论 DAPI荧光定量检测方法具有直接、可靠、易于操作、定量检测等特点,可为进一步研究polyP在肠出血型大肠埃希菌O157:H7中的作用提供技术支持.
关键词：无机多聚磷酸盐DAPI染色大肠杆菌O157:H7
资助基金：国家自然科学基金(81371765)广东省自然科学基金(2018B030311063)广东省自然科学基金(2014A030313312)
论文发表日期：2019-03-02
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：7( 344-350 )
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