重组人HER3胞外域Ⅰ区183-227aa的原核表达及大鼠多克隆抗体的制备与鉴定
朱磊1
袁平川2
赵志刚3
王鑫3
王国栋2
颜亮4
1.安徽省多糖药物工程技术研究中心,安徽芜湖241002;皖南医学院药物研发中心,安徽芜湖241002;活性生物大分子研究安徽省重点实验室,安徽芜湖241002;皖南医学院药物筛选与评价研究所,安徽芜湖2410022.安徽省多糖药物工程技术研究中心,安徽芜湖241002;皖南医学院药物研发中心,安徽芜湖241002;活性生物大分子研究安徽省重点实验室,安徽芜湖2410023.安徽省多糖药物工程技术研究中心,安徽芜湖241002;皖南医学院药物研发中心,安徽芜湖2410024.活性生物大分子研究安徽省重点实验室,安徽芜湖241002
摘要：目的 原核表达、纯化由人表皮生长因子受体3 (HER3) 183-227aa肽段(HER3Ⅰ)和麻疹病毒蛋白288-302aa肽段(MVF)融合构建的重组肽(MVF-HER3Ⅰ),并制备其多克隆抗体.方法 将MVF与HER3Ⅰ融合构建重组肽MVF-HER3Ⅰ,用化学合成法合成重组肽基因,并将其与pET21b质粒和含有硫氧还蛋白(Trx)基因的pET32a质粒连接构建重组肽表达质粒,重组质粒用双酶切法鉴定.将重组质粒导入到大肠杆菌BL21 (DE3)并进行表达参数优化及诱导表达.融合蛋白依次经镍离子亲和层析、肠激酶酶切和再次镍离子亲和层析制备重组肽.表达和纯化过程中的样品纯度和相对分子质量用SDS-PAGE分析.以纯化的重组肽为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体.用ELISA法测定抗重组肽多克隆抗体效价,免疫印迹和免疫沉淀法分析抗重组肽多克隆抗体对重组肽和非变性状态HER3的识别,激光共聚焦法分析抗重组肽多克隆抗体与MCF7细胞的结合,磺酰罗丹明B染色法测定在有无神经调节素刺激下抗重组肽多克隆抗体对高表达HER3的MCF7细胞的增殖抑制作用.结果 成功构建了重组肽的两种表达质粒,重组肽基因不能单独表达,但和Trx融合后可在37℃、0.2 mmol/L IPTG条件下呈可溶高表达.融合蛋白经亲和层析、酶切和再次亲和层析后得到重组肽.重组肽可刺激大鼠产生效价达1∶512 000的抗重组肽多克隆抗体.该抗体不仅可特异性识别重组肽,还可特异性沉淀非变性HER3和结合于MCF7细胞的细胞膜.不管有无神经调节素刺激,该抗体均呈浓度依赖性地抑制HER3高表达的MCF7细胞的增殖(P＜0.01).结论 成功进行了重组肽MVF-HER3Ⅰ的原核表达和纯化,制备并鉴定了抗MVF-HER3Ⅰ多克隆抗体,为在体内外深入研究该抗体对HER3信号通路的影响打下基础.
关键词：人表皮生长因子受体3二聚化融合表达亲和层析多克隆抗体
资助基金：国家自然科学基金(81802651)安徽省自然科学基金(1808085QH291)安徽省自然科学基金(1908085MH248)安徽省高等学校自然科学研究项目(KJ2018A0255)安徽省高等学校自然科学研究项目(KJ2018ZD025)活性生物大分子研究安徽省重点实验室自主研究课题(LAB201801)活性生物大分子研究安徽省重点实验室自主研究课题(LAB201802)皖南医学院大学生科研资助金(WK2019S43)
论文发表日期：2020-06-20
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：8( 806-813 )
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