TEAD1基因敲除对糖尿病性ED大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化的影响
张涛1
李维丽2
邱晓拂1
刘百川1
李高远1
冯才鑫1
廖俊发1
林康健1
1.广东省第二人民医院泌尿外科,广东 广州 5103172.南方医科大学南方医院妇产科,广东 广州 510515
摘要：目的 利用CRISPR/Cas9技术敲除糖尿病性ED大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(CCSMCs)中TEAD1基因,探讨TEAD1基因对糖尿病性ED大鼠CCSMCs表型转化的影响.方法 利用链脲佐菌素建立糖尿病性ED大鼠模型.原代及传代培养CCSMCs,并进行免疫荧光染色鉴定.根据CRISPR/Cas9靶点设计规则设计了3组特异性sgRNA(sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3),构建表达载体并转染293T细胞,包装并收集慢病毒,将其感染糖尿病性ED大鼠CCSMCs,嘌呤霉素筛选阳性细胞,Western blot检测TEAD1蛋白的表达水平.然后将实验分3组:敲除TEAD1基因的糖尿病性ED大鼠CCSMCs为实验组(CCSMCs-sgRNA-2)、空载体病毒感染组为阴性对照组(CCSMCs-sgRNA-NC)、不感染病毒组为空白对照组(CCSMCs-CK),分别使用qRT-PCR和Western blot检测各组细胞表型标志物平滑肌肌球蛋白重链(SMMHC)、碱性调宁蛋白(Calponin)和增殖细胞核抗原(PCNA)mRNA和蛋白水平的表达.结果 原代培养的糖尿病性ED大鼠CCSMCsα-SMA阳性细胞率达95％以上.成功包装了含有TEAD1-sgRNA的重组慢病毒,筛选得到了稳定低表达TEAD1基因的糖尿病性ED大鼠CCSMCs细胞系.Western blot结果显示感染TEAD1-sgRNA-2的糖尿病性ED大鼠CCSMCs中TEAD1蛋白水平最低(P<0.05).qRT-PCR和Western blot结果显示,敲除TEAD1基因的糖尿病性ED大鼠CCSMCs,SMMHC和Calponin mRNA和蛋白水平的表达均显著上调(P<0.05),而PCNA mRNA和蛋白水平的表达均显著减少(P<0.05).结论 利用CRISPR/Cas9基因技术成功构建了定向敲除TEAD1基因的慢病毒载体,TEAD1基因的缺失可使糖尿病性ED大鼠CCSMCs表型从合成型向收缩型转化.
关键词：TEAD1勃起功能障碍糖尿病平滑肌细胞表型转化CRISPR/Cas9
资助基金：国家自然科学基金(81601273)广东省中医药局科研项目(20192004)
论文发表日期：2021-04-20
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：7( 567-573 )
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