过表达TrxR1重组HEK293细胞株的构建和鉴定
吕晓梅1
周知音1
朱丽1
周吉2
黄慧丹1
张超1
刘晓平1
1.皖南医学院药物筛选与评价研究所2.附属弋矶山医院生殖医学中心,安徽 芜湖 241000
摘要：目的 构建稳定过表达硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1)的HEK293细胞株,为TrxR1的功能研究以及靶向TrxR1药物筛选提供细胞模型.方法 通过PCR扩增,连接转化以及Sanger双脱氧测序构建并筛选出TrxR1的重组慢病毒表达载体pLVX-Puro-TXNRD1,转染HEK293细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞株.后续研究分为3组进行:①TrxR1过表达HEK293细胞:pLVX-Puro-TXNRD1载体稳定转染细胞;②对照HEK293细胞:pLVX-Puro空载病毒载体稳定转染细胞;③正常HEK293细胞;通过RT-qPCR、Western blot实验检测上述3组细胞中TrxR1的mRNA以及蛋白表达情况;通过胰岛素终点法以及TRFS-green探针成像检测上述3种细胞内TrxR1的酶活力;通过CCK8实验检测上述3种细胞对TrxR1特异性抑制剂auranofin的敏感性.结果 构建载体经DNA测序,成功获得插入TrxR1的重组慢病毒表达载体pLVX-Puro-TXNRD1.与HEK293以及HEK293-NC细胞相比,HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1的mRNA和蛋白高表达,且酶活力也同样显著上升(P<0.005);而与HEK293以及HEK293-NC细胞相比,auranofin对HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1酶活力以及细胞增殖的抑制效率均显著下降(P<0.005).结论 通过构建pLVX-Puro-TXNRD1慢病毒载体,成功获得过表达TrxR1酶的HEK293细胞株,该细胞对特异性靶向TrxR1的抑制剂的抗增殖作用具有抵抗,因而可用于靶向TrxR1药物的筛选.
关键词：硫氧还蛋白还原酶1慢病毒包装过表达细胞模型
资助基金：国家自然科学基金(82104011)安徽省自然科学基金(2108085MH319)安徽省重点研究与开发计划项目(202004a07020041)安徽省高校自然科学研究重大项目(KJ2019ZD30)
论文发表日期：2022-04-20
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：7( 554-560 )
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