表达工程化剪接因子腺病毒的构建及其在调控乳鼠心肌细胞中的YAP1可变剪接中的应用
李阳1
赵倩2
宋晓伟3
宋金超4
1.上海理工大学健康科学与工程学院,上海 200082;上海理工大学附属市东医院麻醉科,上海 2000822.上海理工大学健康科学与工程学院,上海 2000823.海军军医大学第一附属医院心血管内科,上海 2000824.上海理工大学附属市东医院麻醉科,上海 200082
摘要：目的 构建人工剪接因子,实现调控心肌细胞YAP1的可变剪接.方法 本研究根据Pumilio1的序列特异性,针对YAP1的Exon6构建不同序列的剪接因子.实验分为3组:野生型PUF-SR作为阴性对照组、人工化的PUF-SR腺病毒转染组、质粒转染组.实验流程:使用同源重组的方法构建腺病毒,将人工化的PUF-SR的PCR片段克隆到pAd-Track质粒中,再将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中进行质粒扩增.扩增后的质粒经PacⅠ酶切后,转染到293A细胞,进行腺病毒包装.将得到的腺病毒载体转染到培育的乳鼠心肌细胞中.选用Ad-Track质粒用于对照转染组,通过载体转染法将其转染到乳鼠心肌细胞中.定量和半定量PCR法检测YAP1的可变剪接,Western blot法检测融合蛋白Flag的信号,并使用GAPDH抗体检测GAPDH作为加载对照.结果 腺病毒转染组对心肌细胞的转染效率接近100％,质粒转染组中并没有发现荧光蛋白.在Western blot实验中,阴性对照和靶向YAPExon6XULIE序列的Flag-SR-NLS-PUF都能够检测到融合Flag的蛋白的表达.在反转录PCR和PCR检测YAP1的可变剪接实验中,结果都显示YAP1的第4个target序列所构建的人工剪接因子能够有效调控YAP1 Exon 6的剪入(P<0.05).结论 本实验成功构建出能够调控YAP1可变剪接的腺病毒,并且在SD大鼠的心肌细胞中得到了验证.
关键词：工程化剪接因子腺病毒YAP1可变剪接
资助基金：上海市杨浦区科委/卫健委科研面上项目(YPM202105)
论文发表日期：2022-07-20
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：6( 1013-1018 )
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