分泌型PD-1抗体可提高c-Met CAR-T细胞对胰腺癌细胞的杀伤作用
闵静婷1
彭上1
杜娜娜1
安然2
甄翔程3
曹佳威3
周陈航4
李正红5
1.蚌埠医科大学 基础医学院,安徽 蚌埠 2330002.蚌埠医科大学 公共基础学院,安徽 蚌埠 2330003.蚌埠医科大学 临床医学院,安徽 蚌埠 2330004.蚌埠医科大学 口腔医学院,安徽 蚌埠 2330005.蚌埠医科大学 生命科学学院,安徽 蚌埠 233000
摘要：目的 设计并制备能够分泌PD-1抗体和靶向c-Met的CAR-T细胞,以消除肿瘤对CAR-T细胞的免疫抑制作用,从而提高CAR-T细胞对胰腺癌的治疗效果.方法 采用Kaplan-Meier Plotter、GEPIA和Timer2.0生物信息学数据库,分析c-Met在胰腺癌中的表达、生存期及免疫浸润.免疫组化检测胰腺癌临床样本c-Met和PD-L1表达,流式细胞术验证胰腺癌细胞Aspc-1 c-Met和PD-L1表达通过基因编辑将PD-1分泌型抗体和HIS标签连接至2代c-Met CAR分子后,构建PD-1/c-Met CAR质粒并包被慢病毒,慢病毒感染至活化T细胞内,通过流式细胞技术检测CAR-T阳性率和细胞亚群;Western blotting检测分泌型PD-1抗体在细胞上清液中的存在;体外功能试验中,通过LDH释放实验检测CAR-T对靶细胞的杀伤效率,CCK-8检测靶细胞存在下PD-1抗体对CAR-T增殖的促进作用.ELISA检测PD-1/c-Met CAR-T和c-Met CAR-T活化后细胞因子的分泌量.结果 生信分析结果显示,胰腺癌组织c-Met表达高于正常组织(P<0.01);c-Met表达水平与胰腺癌患者生存期呈负相关(P<0.01).c-Met的表达可能与多种免疫细胞浸润成正相关.免疫组化结果显示,胰腺癌c-Met和PD-L1表达均高于癌旁组织(P<0.01);流式细胞术结果显示,Aspc-1细胞c-Met和PD-L1表达量为90.7%和57.7%,琼脂糖凝胶电泳显示成功制备四代PD-1/c-Met CAR分子;流式细胞术和Western blotting显示,成功构建PD-1/c-Met CAR-T且PD-1抗体可顺利分泌.体外功能验证中LDH结果显示,PD-1/c-Met CAR-T对肿瘤细胞杀伤效率在效靶比为20:1时高于c-Met CAR-T(P<0.01);CCK-8实验结果显示,靶细胞刺激72 h后增殖效率高于c-Met CAR-T(P<0.01);ELISA结果显示,PD-1/c-Met CAR-T分泌的细胞因子IL-2和TNF-α高于c-Met CAR-T(P<0.01).结论 PD-1抗体分泌型c-Met CAR-T可成功构建,并在体外胰腺癌细胞上显示出优于c-Met CAR-T肿瘤杀伤效率和增殖效率.
关键词：嵌合抗原受体T细胞c-MetPD-1分泌型抗体胰腺癌
资助基金：安徽高校自然科学研究项目(2023AH051991)安徽高校自然科学研究项目(2022AH040224)国家级大学生创新创业训练计划项目(202310367011)国家级大学生创新创业训练计划项目(202410367005)
论文发表日期：2024-10-20
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：9( 1976-1984 )
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