基于PCR-CRSIPR/Cas12a的DNMT3A R882H/C可视化检测方法
蒋清杨1
孙如美2
缪夏萍2
范喜杰2
张浩名3
夏银骁1
李凯敏4
陈涛5
1.广州医科大学金域检验学院,广东 广州 5101822.广州市金域转化医学研究院有限公司,广东 广州 5102203.广州医科大学金域检验学院,广东 广州 510182;广州市金域转化医学研究院有限公司,广东 广州 5102204.烟台毓璜顶医院,山东 烟台 2640005.广州医科大学金域检验学院,广东 广州 510182;广州市金域转化医学研究院有限公司,广东 广州 510220;广州金域医学检验中心有限公司感染性疾病检测中心,广东 广州 510220
摘要：目的 开发一种基于聚合酶链式反应(PCR)和成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)及其相关蛋白(Cas12a)系统的DNMT3A R882H(c.2645G>A)/C(c.2644C>T)可视化检测系统.方法 选取2023年9月～2024年9月于烟台毓璜顶医院收集的34例疑似急性髓系白血病患者的骨髓样本.针对DNMT3A R882H/C突变位点序列,首先设计PCR-Cas12a核酸检测系统所需的特异性扩增引物和CRISPR RNA(crRNA).通过琼脂糖凝胶电泳筛选出扩增性能较好的引物对,并利用Cas12a蛋白切割邻近荧光探针产生的荧光强度,基于突变型和野生型信号的差异筛选出切割效果最好的crRNA,构建PCR-Cas12a核酸检测系统.随后将野生型人基因组DNA和DNMT3A R882H/C突变质粒按不同比例混合,模拟不同突变率,评价PCR-Cas12a的最低检测限.最后,使用PCR-Cas12a检测已通过高通量测序技术验证DNMT3A R882H/C突变率的临床样本,评估方法学的一致性和抗干扰能力.结果 本研究建立的PCR-Cas12a核酸可视化检测系统,能够有效检出突变率为1%的DNMT3A R882H/C临床样本.结论 本研究结合PCR与CRISPR-Cas12a技术,建立了一种检测DNMT3A R882H/C突变位点的可视化方法,具有快速以及特异度、敏感度高的特点,为急性髓系白血病的预后评估提供有力支持.
关键词：CRISPR/Cas12aDNMT3A R882HDNMT3A R882C急性髓系白血病可视化检测
资助基金：市校(院)企联合资助专题(2023A03J0542)(2023A03J0542)
论文发表日期：2025-05-20
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：8( 589-596 )
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