截短型人转化生长因子βⅡ型受体胞外域的表达及活性分析
韩瑞杰1
王小花2
左魁阳3
初彦辉3
李桂芹1
刘海峰3
1.牡丹江医学院附属红旗医院肾内科,黑龙江牡丹江,1570112.牡丹江医学院基础医学院病原与免疫实验室,黑龙江牡丹江,1570113.牡丹江医学院医药研究中心,黑龙江牡丹江,157011
摘要：目的 构建截短型人转化生长因子βⅡ型受体胞外域( thTβRⅡ)原核表达载体,诱导表达纯化thTβRⅡ蛋白,并分析其生物学活性.方法 以本实验室前期构建的TβRⅡ全长基因片段( pGEX-4T1-TβRⅡ)为模版,常规PCR扩增出带有 NdeI和BamHI酶切位点的thTβRⅡ目的基因,并插入原核表达载体pET28a,命名为pET28a-thTβRⅡ.将经过PCR、双酶切和DNA测序正确的pET28a-thTβRⅡ转化至大肠杆菌Rossta诱导表达,用Ni2+亲和层析纯化获得高纯度thTβRⅡ目的蛋白,经SDS-PAGE进行纯度分析,MTT法观察其对转化生长因子-β1(TGF-β1)活化的人肝星状细胞LX-2增殖活性的影响,real-time RT-PCR及Western blot检测其对TGF-β1、纤连蛋白(FN)mRNA及FN、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达的影响.结果 pET28a -thTβRⅡ原核表达载体构建成功,宿主菌 Rossta/pET28a -thTβRⅡ在37℃经0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导5 h获得目的蛋白thTβRⅡ的大量表达,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,通过Ni2+亲和层析成功获得高纯度thTβRⅡ,SDS-PAGE鉴定分子量约为18.0 kD, MTT显示150 μg/mL的重组蛋白thTβRⅡ能明显抑制活化的人肝星状细胞LX-2增殖,real-time RT-PCR及Western blot显示200 μg/mL的重组蛋白thTβRⅡ其能显著减少TGFβ1、FNmRNA;FN、α-SMA蛋白的表达.结论 成功构建thTβRⅡ原核表达载体,诱导表达纯化并获得高纯度重组蛋白thTβRⅡ,其能抑制活化的LX-2 细胞增殖并具有抗纤维化作用,为进一步体内外功能研究打下基础.
关键词：TGFβⅡ型受体包涵体纯化
资助基金：国家自然科学基金(81500471)黑龙江省自然科学基金(H2015080)黑龙江省卫生计生委科研项目(2014-212)黑龙江省卫生计生委科研项目(2016-355)
论文发表日期：2018-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：5( 1124-1128 )
英文信息