Bak1腺病毒表达载体的构建及对人成骨肉瘤细胞的影响
柴爽1
黄红2
万雷3
王吉利1
王伟4
黄宏兴3
1.广州中医药大学第三临床医学院 广东广州5100062.广州中医药大学护理学院 广东广州5100063.广州中医药大学附属骨伤科医院骨科 广东广州5102404.中国人民解放军广州疗养院理疗科 广东广州510515
摘要：目的 构建人 Bcl2 拮抗1(Bak1)基因重组表达腺病毒 pAd-Bak1,并感染人成骨肉瘤细胞MG63建立过表达Bak1的细胞模型,检测其对细胞活性的影响.方法 利用qPCR扩增Bak1全长cDNA,利用穿梭质粒pENTER构建载有Bak1基因的重组穿梭质粒pENTER -Bak1,通过基因测序鉴定载体序列.将重组载体PmeⅠ线性化、脱磷酸化后,转入含有腺病毒骨架质粒pAd-Amp的感受态BJ5183细胞中进行基因同源重组.将重组腺病毒质粒pAD-Bak1经PacⅠ酶切线性化后,用Lipofectamine 2000脂质体转染到HEK-293细胞中进行包装扩繁,荧光定量PCR法测定病毒滴度.感染MG63细胞,qPCR和Western blot检测Bak1的表达,MTT检测细胞活性.结果 测序及酶切验证 pENTER-Bak1构建成功. pAD-Bak1 感染MG63 细胞,qPCR检测到细胞中Bak1基因过表达(与NC对照组和空白对照组相比P＜0.01、P＜0.01),Western blot检测到细胞中Bak1蛋白过表达. MTT检测显示与 NC对照组相比,细胞活性减弱(P＜0.05).结论 成功构建了Bak1重组表达腺病毒,验证了其能够感染MG63细胞表达Bak1蛋白,证明了过表达Bak1可以减弱细胞的活性.为进一步研究Bak1的功能奠定了基础.
关键词：人Bcl2拮抗1(Bak1)蛋白重组腺病毒载体人成骨肉瘤细胞MG63
资助基金：国家自然科学基金(81373653)国家自然科学基金(81674004)广东省科技计划(2016A020216024)
论文发表日期：2018-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：5( 1332-1336 )
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