梨火疫病菌活菌快速定量检测方法的建立
袁英哲1
韩剑2
王岩3
罗明2
包慧芳4
张春竹5
黄伟5
1.新疆农业大学农学院,乌鲁木齐8300522.新疆农业大学农学院,乌鲁木齐830052;新疆维吾尔自治区高校农林有害生物监测与安全防控重点实验室,乌鲁木齐8300523.新疆林业科学院现代林业研究所,乌鲁木齐8300004.新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐8300005.新疆巴州农业科学研究院,新疆库尔勒841003
摘要：[目的]将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量PCR技术(qPCR)相结合,建立一种快速检测梨火疫病菌活菌的方法,为病害的检疫和早期诊断,开展病原学、流行规律研究及制定科学防控措施严防病害入侵提供技术支持.[方法]以梨火疫病菌(Erwinia amylovora)质粒pEA29设计特异性引物EaP29F1/EaP29R1,通过优化PMA的质量浓度和曝光时间,确定区分梨火疫病菌死活菌的PMA预处理最优反应条件,再以活菌DNA为模板进行qPCR的特异性扩增.设置不同比例死活菌混合体系,验证PMA-qPCR反应的可靠性.[结果]当梨火疫病菌浓度为1×108 CFU· mL-1、PMA浓度为25 μmol· L-1、曝光时间为10 min时,能完全抑制死菌的扩增,仅以活菌体DNA为靶标进行选择性扩增.当活菌比例为10％～100％时(浓度为6.0× 107～6.0× 108 CFU· mL-1),PMA-qPCR测得的活菌数与理论活菌数值均在同一个数量级,二者存在良好的线性关系(R2=0.992 8).灵敏度检测结果表明,6.0× 103～6.0× 108 CFU· mL-1范围内,梨火疫病菌活菌数与Ct值线性相关(R2=0.994 7),检测灵敏度下限为6× 103 CFU· mL-1(12 CFU/qPCR反应).用建立的PMA-qPCR方法检测人工接种发病的香梨、苹果、杜梨枝条,PMA-qPCR能准确检测其中的活菌,结果与菌落计数结果相符.[结论]本研究建立的PMA-qPCR检测方法能定量检测梨火疫病菌病活菌数量,具有灵敏、准确和高效的优点,避免了常规qPCR检测死菌导致的“假阳性”.
关键词：梨火疫病菌叠氮溴化丙啶(PMA)实时荧光定量PCR(qPCR)活菌
分类号：S661.2(果树园艺)
论文发表日期：2020-09-28
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：9( 1425-1433 )
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