人抗氧化蛋白-1在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定
毛爽1
陈少沛1
颜晟1
王海鹰2
宁正祥2
李杉1
王菊芳1
1.华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州5100062.华南理工大学轻工与食品学院,广东广州510006
摘要：为得到较纯的具有活性的人抗氧化蛋白Peroxiredoxin1(Prx1),本文先用PCR的方法扩增了人Prx1的cDNA序列,然后将其连接到pET28表达载体上,从而构建了编码全长的人抗氧化蛋白-1基因的pET28-Prx1原核表达质粒.经双酶切及测序鉴定后将表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并通过SDS-PAGE和western blot来鉴定表达产物.随后用Ni-NTA螯合亲和层析的方法纯化重组蛋白,并测定该酶的米氏常数,用质粒保护实验鉴定该蛋白其活性.最终表达载体经酶切和测序鉴定证实构建成功,表达产物在SDS-PAGE和western blot图的25 kD左右,与prx1真实的蛋白分子量相符,说明Prx1蛋白成功表达.Prx1纯化后产量达到7.59 mg/g菌体,纯度达到88.50％.纯化后的Prx1在37℃和pH 7.4的条件下催化H2O2反应的米氏常数Km为2.06×10-4mol/L,质粒保护实验表明Prx1可以保护pUC18质粒免受氧化损伤.因此,Prx1在大肠杆菌中成功表达并得到较纯的活性蛋白.
关键词：抗氧化蛋白1重组表达亲和层析蛋白印迹法氧化损伤质粒保护实验
资助基金：重大新药创制"科技重大专项(2011ZX09506-001)新世纪优秀人才支持计划(NCET-10-0399;2012M521593;2013T60796)
论文发表日期：2014-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
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