多靶点沉默CCR5基因载体构建及沉默效果验证
张雅靖1
鲁世金2
魏训东3
朱其凤2
马洁2
1.530000 广西南宁,广西中医药大学研究生院2.广西中医药大学附属瑞康医院中西医结合转化医学中心3.北京医院生物治疗中心/国家老年医学中心/中国医学科学院老年医学研究院
摘要：目的 筛选沉默CCR5基因的靶点并验证多靶点沉默CCR5基因的效果.方法 检索人CCR5基因的cDNA序列,设计针对CCR5 mRNA的siRNA,选择与靶基因结合具有高特异性的3个siRNA序列,合成shRNA双链,构建多靶点沉默CCR5重组质粒.同时合成CCR5过表达质粒.经测序验证后进行质粒慢病毒包装.首先,用CCR5过表达慢病毒转染Jurkat T细胞,实时荧光逆转录定量聚合酶链反应(real-time reverse transcription quantitative poly-merase chain reaction,RT-qPCR)检测CCR5过表达情况.Control组(空白对照)为Jurkat T细胞,将CCR5过表达细胞分组为CCR5-OE组(CCR5过表达)、CCR5-OE-NC组(CCR5过表达阴性对照)、CCR5-OE-沉默组(CCR5过表达沉默).RT-qPCR和Western bolt检测CCR5沉默重组质粒对目的基因的沉默效果.实验中各项数据的分析选用SPSS软件,作图选用GraphPad Prism软件.结果 测序结果证明,CCR5过表达质粒含有目的序列,CCR5沉默重组质粒中含有3个目的靶点序列.RT-qPCR检测CCR5过表达情况显示,细胞CCR5的基因表达显著升高,可进行后续实验.CCR5沉默慢病毒感染后,RT-qPCR和Western bolt检测各组CCR5表达结果显示,多靶点CCR5沉默组的CCR5基因表达水平和蛋白表达水平较CCR5-OE组降低(P均＜0.05).结论 成功构建多靶点沉默CCR5基因重组质粒,验证多靶点沉默CCR5基因的有效性,为基因编辑治疗艾滋病提供实验数据.
关键词：CCR5多靶点基因沉默载体构建
分类号：R456(治疗学)
资助基金：国家自然科学基金(82260944)广西科技基地和人才专项项目(2021AC18006)广西科技基地和人才专项项目(2021AC19393)广西研究生教育创新计划项目(YCXJ2021093)
论文发表日期：2023-05-28
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：8( 367-374 )
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