过表达CXCR7介导AKT信号通路对人肝细胞癌细胞新血管生成的调控机制

吴刚

摘要：目的研究过表达CXCR7通过AKT信号通路诱导人肝细胞癌细胞新血管生成的作用机制.方法 (1)检测CXCR7基因在SMMC-7721,Huh-7,HepG2,BEL-7402和MHCC-97H五种肝细胞癌细胞中的表达量,选取最适合癌细胞株进行转染实验;(2)转染Lenti-CXCR7-GFP慢病毒到BEL-7402细胞,观察转染后细胞形态,获得纯Lenti-CXCR7-GFP转染的BEL-7402细胞液;(3)检测CXCR7、p-AKT(phospho-AKT)、AKT、MMP2和MMP9表达量;(4)qRT-PCR法检测肝细胞癌中CXCR7与VEGF mRNA表达;(5)通过AKT通路抑制剂LY294002处理BEL-7402细胞,检测4组(Lenti-CXCR7-GFP-BEL-7402+DMEM处理组、Lenti-CXCR7-GFP-BEL-7402+LY294002处理组、Lenti-GFP-BEL-7402+DMEM处理组、Lenti-GFP-BEL-7402+LY294002处理组)细胞中CXCR7与VEGF蛋白表达;(6)采用鸡胚绒毛尿囊膜法检测BEL-7402肿瘤血管生成情况.结果 (1)Western blot实验结果表明正常肝细胞中CXCR7基因表达量很少,5株癌细胞中BEL-7402的CXCR7表达量相对较低,所以我们选择BEL-7402肝癌细胞株进行转染实验;(2)用倒置荧光显微镜观察细胞形态,可见大部分细胞均呈绿色荧光显色,表明Lenti-CXCR7-GFP转染到BEL-7402细胞后细胞活性较好,转染已经成功;(3)AKT通路相关蛋白表达量检测结果表明CXCR7、p-AKT,MMP2和MMP9蛋白表达量结果显示实验组显著高于对照组;(4)转染Lenti-CXCR7-GFP的BEL-7402肝癌细胞中CXCR7基因处于过表达状态,VEGF mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05);(5)转染Lenti-CXCR7-GFP的BEL-7402细胞+LY294002处理组中VEGF蛋白表达量比正常转染Lenti-CXCR7-GFP的BEL-7402细胞组明显下降(P<0.05).通过单纯Lenti-GFP转染的细胞(对照组)与Lenti-GFP转染+LY294002(处理组)相比,VEGF表达水变化较小(P>0.05);(6)接种BEL-7402细胞后,鸡胚绒毛尿囊膜中血管密度增加形成血管瘤,CAM增厚,结构不规则,血管加粗且呈放射状分布,Lenti-CXCR7-GFP转染BEL-7402肝细胞后,鸡胚绒毛尿囊膜中血管密度增加,增强了血管生成能力.结论肝细胞癌中CXCR7的过表达促进新血管生成的作用是经由激活了肝细胞癌中的AKT信号通路而诱导产生实现,CXCR7可能是AKT信号通路的一个重要激活剂.