TLR4胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及鉴定
段朝霞
蒋建新
杨清武
张道杰
陈永华
朱佩芳
1.第三军医大学大坪医院野战外科研究所四室,重庆,4000422.第三军医大学大坪医院野战外科研究所四室,重庆,4000423.第三军医大学大坪医院野战外科研究所四室,重庆,4000424.第三军医大学大坪医院野战外科研究所四室,重庆,4000425.第三军医大学大坪医院野战外科研究所四室,重庆,4000426.第三军医大学大坪医院野战外科研究所四室,重庆,400042
摘要：目的构建谷胱甘肽转硫酶-TLR4融合蛋白表达载体,并研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达.方法利用PCR从含TLR4全长cDNA序列的质粒中扩增其胞外段,约1 800 bp,然后将其克隆入pMD18-T载体中.测序确证后重组入谷胱甘肽转硫酶融合表达载体pGEX-4T-1中,并用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达.结果 PCR扩增的TLR4胞外区基因序列与GenBank数据库中的序列一致.重组质粒经酶切鉴定及测序证实,TLR4基因已正确插入到pGEX-4T-1中.重组表达质粒转化感受态大肠杆菌HB101后用IPTG诱导,获得Mr 92 000的GST-TLR4融合蛋白;37 ℃,0.2 mmol/L IPTG诱导4 h,SDS-PAGE电泳后,经薄层凝胶扫描分析该融合蛋白占菌体蛋白总量34.25%,部分以包涵体存在,可溶性蛋白约占27.84%;亲和层析纯化后纯度大于90%.Western-blot证实GST-TLR4融合蛋白能与TLR4单抗特异性结合.结论成功地构建融合蛋白表达载体pGEX-TLR4,并在大肠杆菌中获得有效表达,获得了纯度大于90%的可溶性GST-TLR4融合蛋白,为进一步研究其功能及制备TLR4单克隆抗体奠定了基础.
关键词：TLR4融合蛋白可溶性表达纯化
分类号：Q786(基因工程（遗传工程）)
资助基金：国家重点基础研究发展计划（973计划）(G1999054203)国家自然科学基金(30170968)
论文发表日期：2003-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：4( 274-277 )
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