MRSA耐药相关TG-TPase嵌合基因的原核表达与纯化
杨杰
饶贤才
侯瑞
胡晓梅
陈志瑾
丛延广
谭银铃
朱军民
周莹冰
胡福泉
1.第三军医大学微生物学教研室,重庆,4000382.第三军医大学微生物学教研室,重庆,4000383.第三军医大学微生物学教研室,重庆,4000384.第三军医大学微生物学教研室,重庆,4000385.第三军医大学微生物学教研室,重庆,4000386.第三军医大学微生物学教研室,重庆,4000387.第三军医大学微生物学教研室,重庆,4000388.第三军医大学微生物学教研室,重庆,4000389.第三军医大学微生物学教研室,重庆,40003810.第三军医大学微生物学教研室,重庆,400038
摘要：目的 设计、构建耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)耐药相关TGTPase嵌合基因,进行原核表达、纯化探索,为进一步利用其酶学活性建立抑制剂筛选系统奠定基础.方法 通过引物设计,从盐平板法筛选的MRSA菌株中分别克隆PBP2的TG基因片段和PBP2a的TP片段,分别克隆入T载体,对阳性重组子进行酶切/再连接,构建TG-TPase嵌合基因,经核苷酸测序鉴定正确的嵌合基因再亚克隆到pET22b,构建表达载体,转化Rosetta(DE3)plysS,用LPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白进行SDS-PAGE、质谱和Westem blotting鉴定.小量发酵重组菌,对嵌合基因表达产物进行初步纯化.结果 从13株临床分离的金葡菌中筛选出2株高耐药性MRSA菌株,用PCR法从中成功地克隆到青霉素结合蛋白PBP2的TG片段和PBP2a的TP片段,构建了TG-TPase嵌合基因及其原核表达载体,并在大肠埃希菌中表达,产量达菌体总蛋白的43%.融合蛋白纯化分析表明,嵌合蛋白以包涵体形式存在,在变性条件下经Ni-NTA亲和柱纯化,纯度达90%以上.结论 成功设计并构建了耐药性金葡菌TG-TPase嵌合基因及其重组表达工程菌,为进一步利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选奠定基础.
关键词：MRSATG-TPase原核表达纯化鉴定
分类号：R978.1(药品)Q784(基因工程（遗传工程）)
资助基金：国家自然科学基金(30571666)
论文发表日期：2008-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：6( 158-162,166 )
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