截短型BAP31/GST基因重组质粒的构建及融合蛋白的表达、纯化和鉴定
李海涛
宋朝君
孙元杰
魏玉英
李永明
刘飞
刘志佳
张葵
金伯泉
杨琨
1.第四军医大学基础部免疫学教研室,西安,7100322.第四军医大学基础部免疫学教研室,西安,7100323.第四军医大学基础部免疫学教研室,西安,7100324.第四军医大学基础部免疫学教研室,西安,7100325.第四军医大学基础部免疫学教研室,西安,7100326.第四军医大学基础部免疫学教研室,西安,7100327.第四军医大学基础部免疫学教研室,西安,7100328.第四军医大学基础部免疫学教研室,西安,7100329.第四军医大学基础部免疫学教研室,西安,71003210.第四军医大学基础部免疫学教研室,西安,710032
摘要：目的 构建编码截短型肿瘤抗原BAP31(△BAP31)与GST融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并对融合蛋白(△BAP31/GST)进行纯化和初步鉴定.方法 PCR扩增编码△BAP31的基因片段,上下游分别引入EcoR Ⅰ及Xho Ⅰ酶切位点,亚克隆至含有GST标签的原核表达载体pGEX4T-1中,构建重组表达载体pGEX4T1-△BAP31,将该载体转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达△BAP31/GST,用GST亲和层析分离纯化原核表达的△BAP31/GST,表达产物分别用SDS-PAGE和West-ern blot进行鉴定.结果 重组质粒经限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定和IPTG诱导表达△BAP31/GST的SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量为40 000,与理论值相符,并主要以可溶性蛋白形式存在;经过对融合蛋白表达条件的优化,在IPTG浓度为1 mmol/L,诱导6 h目的蛋白表达量最高;灰度扫描分析发现,融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的70.6%,纯化产物的纯度最高可达94.5%,Western blot证实该△BAP31/GST可与抗GST单克隆抗体(mAb)发生特异性结合反应,分子量为△BAP31与GST分子量之和,提示为融合蛋白.结论 成功构建了编码△BAP31基因原核表达载体pGEX4T1-△BAP31,利用大肠杆菌表达系统和GST亲和层析,获得了较高纯度的△BAP31/GST融合蛋白,为进一步研究肿瘤抗原BAP31的功能及开发以BAP31作为靶点的肿瘤疫苗提供了试验基础.
关键词：截短型BAP31(△BAP31)GST融合蛋白蛋白表达纯化
分类号：R392.11(医学免疫学)
资助基金：国家高技术研究发展计划（863计划）(2006AA02A237)国家自然科学基金(30872371)
论文发表日期：2011-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
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