抗耐药性金黄色葡萄球菌嵌合药靶的设计与构建
杨杰
饶贤才
侯瑞
胡珍
方昕
陈志瑾
1.第三军医大学基础部微生物学教研室重庆市微生物工程重点实验室,重庆,4000382.第三军医大学基础部微生物学教研室重庆市微生物工程重点实验室,重庆,4000383.第三军医大学基础部微生物学教研室重庆市微生物工程重点实验室,重庆,4000384.第三军医大学基础部微生物学教研室重庆市微生物工程重点实验室,重庆,4000385.第三军医大学基础部微生物学教研室重庆市微生物工程重点实验室,重庆,4000386.第三军医大学基础部微生物学教研室重庆市微生物工程重点实验室,重庆,400038
摘要：设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药相关TG-Tpase嵌合基因,进行分子建模及三维结构观察,并构建了原核表达质粒,进行嵌合基因的表达、纯化,为进一步利用其酶学活性建立抑制分子筛选系统奠定基础.运用Bioedit和DNAStar软件对MRSA耐药性相关转糖基酶(Tgase)和转肽酶(Tpase)活性片段序列和活性区结构特点及其活性发挥进行分析,设计TG-Tpase嵌合药靶,并通过引物设计从MRSA菌株中克隆PBP2的TG基因片段和PBP2a的TP基因片段,进一步用引物延伸法、酶切连接等分子生物学操作构建TG-Tpase嵌合基因并亚克隆至原核表达质粒pET30b中,转化Rosetta(DE3) plysS 大肠埃希菌,用IPTG进行诱导表达,并小量发酵重组菌,对嵌合基因表达产物进行初步纯化和Western blotting鉴定.设计的TG-Tpase嵌合药靶包括PBP2分子的Tgase活性区、绞链区的N-端,PBP2a分子绞链区C-端及完整的Tpase结构域,融合基因为1935 bp,编码645个氨基酸,等电点为7.10,相对分子质量72000.用PCR法从MRSA菌株中成功克隆了青霉素结合蛋白PBP2的TG片段和PBP2a的TP片段,构建了TG-Tpase嵌合基因及其原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达出药靶蛋白,表达结果与预期设计相符合.融合蛋白纯化分析表明,融合蛋白以包涵体形式存在,在变性条件下经Ni-NTA亲和柱纯化,纯度达90％以上.成功设计、构建了耐药性金葡菌TG-Tpase嵌合基因及其重组表达工程菌,并对融合蛋白进行了初步纯化,为进一步利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选奠定基础.
关键词：MRSA分子设计TG-TPase原核表达鉴定
分类号：R378.1+1(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)
资助基金：国家自然科学基金(30571666)
论文发表日期：2011-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
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