Six2基因shRNA敲减慢病毒表达载体及其稳定细胞株的构建
高锦
亢小玉
1.徐州医学院,江苏徐州,2210042.徐州医学院,江苏徐州,221004
摘要：目的：筛选并包装Six2基因shRNA敲减的慢病毒，建立稳定表达敲减Six2基因的黑质多巴胺能神经元MES23．5细胞系。方法合成三种（分别命名为pLV-shSix2-1、pLV-shSix2-2、pLV-shSix2-3）含敲减Six2基因干扰序列的双链DNA oligo，并将其连接于含有嘌呤霉素抗性的pLV-H1-EF1a载体质粒，均采用慢病毒包装四质粒系统（pRRE/pVSVG/pREV/pLV）包装并转染腺病毒 E1A 基因的人肾上皮细胞系（293T 细胞）以获取慢病毒 pLV-shSix2。收集敲减Six2基因的pLV-shSix2-1、pLV-shSix2-2、pLV-shSix2-3慢病毒质粒及对照质粒上清，感染黑质多巴胺能神经元细胞（MES23．5细胞），分别设为pLV-shSix2-1组、pLV-shSix2-2组、pLV-shSix2-3组及对照组，Western blot法检测各组细胞 Six2蛋白表达，鉴定各组Six2干扰序列的敲减效果。嘌呤霉素法筛选稳定敲减 Six2的MES23．5细胞株。结果酶切结果表明在262 bp及约9000 bp处分别有明显条带，测序结果显示所测序列与敲减的Six2干扰序列完全一致。 Western blot结果显示干扰序列shSix2-2对应的细胞中Six2蛋白表达显著降低，shSix2-1和shSix2-3蛋白表达降低效果不明显。用嘌呤霉素筛选病毒感染的pLV-shSix2-2组细胞系成功。结论成功构建并筛选了Six2基因shRNA敲减慢病毒表达载体，建立了稳定敲减Six2基因的MES23．5细胞株。
关键词：Six2胶质细胞系源性神经营养因子慢病毒载体构建基因敲减
分类号：R394.3(医学遗传学)R742.5(神经病学与精神病学)
资助基金：国家自然科学基金(31040035)
论文发表日期：2014-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：4( 4-7 )
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