靶向线粒体的mt-roGFP2荧光探针检测人肝癌HepG2细胞线粒体ROS水平动态变化
刘晓宁
薄惠
刘翠娥
1.黄河科技学院医学院,郑州,4500632.黄河科技学院医学院,郑州,4500633.黄河科技学院医学院,郑州,450063
摘要：目的 通过靶向线粒体的氧化还原敏感绿色荧光蛋白探针(mt-roGFP2荧光探针)检测人肝癌HepG2细胞(以下称HepG2细胞)线粒体活性氧(ROS)水平动态变化,旨在为以线粒体ROS为靶标的肝癌化疗奠定基础.方法 采用无缝克隆技术构建pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro慢病毒载体并测序鉴定.将慢病毒载体pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro与包装质粒pVSVg、pRev和pGag-Pol共转染人肾上皮293T细胞,获得mt-roGFP2慢病毒颗粒,并检测病毒滴度.将制备好的mt-roGFP2慢病毒颗粒感染HepG2细胞,通过荧光显微镜和Western blotting法鉴定观察HepG2细胞roGFP表达情况.将对数生长期稳定表达mt-roGFP2的HepG2细胞(HepG2-mtroGFP2细胞)与MitoTracker线粒体荧光探针共温育,采用激光共聚焦显微镜观察mt-roGFP2荧光探针的亚细胞定位.取对数生长期HepG2-mt-roGFP2细胞先后经0.5 mmol/L过氧化氢(H2O2)和1 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)处理,采用尼康A1R激光扫描共聚焦显微镜拍摄同一细胞,Image J软件分析荧光图片.结果 成功构建pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro慢病毒载体.制备的mt-roGFP2慢病毒平均滴度为4.04×108 IU/mL.mt-roGFP2荧光探针稳定表达在HepG2细胞中,并正确靶向HepG2细胞线粒体,成功构建HepG2-mt-roGFP2细胞.外源性氧化剂H2O2的加入可导致HepG2-mt-roGFP2细胞线粒体ROS水平明显升高,其荧光比值(405 nm/488 nm)从1.19上升到3.98,加入还原剂DTT可使其荧光比值下降至1.25.结论 靶向线粒体的mt-roGFP2荧光探针能够实时动态、可逆地检测HepG2细胞线粒体ROS水平变化并实时成像.
关键词：肝癌HepG2细胞活性氧线粒体靶向线粒体的氧化还原敏感绿色荧光蛋白探针
分类号：R735.7(消化系肿瘤)
资助基金：河南省高等学校重点科研项目(16A180046)郑州市科技发展计划(20150350)
论文发表日期：2018-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：4( 14-17 )
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