差速离心、密度梯度离心、超滤离心技术在骨髓间充质干细胞外泌体提取中的应用对比观察
罗靖莹
贺宏丽
郭阳
黄玮玮
黄晓波
1.电子科技大学附属医院/四川省人民医院,成都,6100722.电子科技大学附属医院/四川省人民医院,成都,6100723.电子科技大学附属医院/四川省人民医院,成都,6100724.电子科技大学附属医院/四川省人民医院,成都,6100725.电子科技大学附属医院/四川省人民医院,成都,610072
摘要：目的 观察差速离心、密度梯度离心、超滤离心技术在骨髓间充质干细胞(BMSCs)外泌体提取中的应用,筛选外泌体最佳离心提取方法.方法 取BMSCs培养48 h后收集细胞上清,平均分成A、B、C组,分别使用差速离心技术、密度梯度离心技术、超滤离心技术提取外泌体;记录各组外泌体提取时间;采用负染色技术观察各组外泌体形态;使用纳米颗粒跟踪分析仪测算各组外泌体浓度及大小;采用BCA法测定外泌体总蛋白浓度;采用Western blotting法检测各组外泌体表面标志蛋白CD9、CD63、Alix.将肺微血管内皮细胞(PMVECs)分成5组,EC组上室加入PMVECs及培养基;LPS组上室加入PMVECs及含LPS的培养基(构建内皮细胞损伤模型);A、B、C组上室加入方法同LPS组,下室分别加入A、B、C组外泌体;采用葡聚糖渗漏实验检测外泌体内皮细胞通透性(观察外泌体对内皮细胞的修复作用),以内皮细胞通透指数表示.结果 A、B、C组的外泌体的提取时间分别为(180±8)、(203±10)、(40±5)min,A、B组外泌体的提取时间与C组相比,P均＜0.05.各组外泌体均为大小不等的椭圆形或圆形的膜性结构,边界清晰,但仅A组外泌体可见到典型的杯状结构.A、B、C组的外泌体浓度分别为(4.46±0.38)×108/mL、(5.11±0.16)×108/mL、(2.18±0.17)×108/mL,A、B组与C组外泌体浓度相比,P均＜0.05.A、B、C组的外泌体大小均为20 ～ 100 nm.A、B组外泌体总蛋白浓度及CD63、Alix的相对表达量均显著高于C组(P均＜0.05).A、B、C、LPS、EC组的内皮细胞通透指数分别为2.17 ±0.15、1.77±0.32、2.37±0.42、2.93±0.15、1.00±0.00,A、B、C、LPS组的内皮细胞通透指数与EC组相比,P均＜0.05;A、B组的内皮细胞通透指数与LPS组相比,P均＜0.05.结论 密度梯度离心技术虽耗时较长,但提取的外泌体纯度、浓度较高,对内皮细胞的修复作用较强,可以作为科研和临床研究的首选外泌体离心提取方法.
关键词：外泌体外泌体提取方法差速离心技术密度梯度离心技术超滤离心技术间充质干细胞骨髓间充质干细胞肺微血管内皮细胞
分类号：R33(人体生理学)
资助基金：四川省医学科学院·四川省人民医院青年博士基金(2015BS07)
论文发表日期：2019-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：5( 48-52 )
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