基于CRISPR/Cas9技术构建NPHP1基因敲除的肾集合管上皮细胞
陈华木1
孙良忠1
胡妙月1
林宏容1
王海燕2
钟静琳3
吴小红3
1.中山大学附属第一医院,广州5100802.中山大学孙逸仙纪念医院3.南方医科大学南方医院
摘要：目的 利用CRISPR/Cas9技术构建NPHP1基因敲除的肾集合管上皮细胞,为肾单位肾痨(NPHP)发病机制的研究提供体外细胞模型.方法 针对犬NPHP1第5外显子区域设计3对引导RNA序列(sgRNA),构建重组真核表达载体PX459-sgRNA;以脂质体Lipo2000转染犬肾集合管上皮细胞MDCK,嘌呤霉素筛选成功转染细胞.基因测序和脱靶检测以验证敲除位点,分别采用RT-qPCR和Western blotting法检测敲除靶基因的mRNA和蛋白,显微镜下观察细胞形态变化.以慢病毒转染shRNA敲低NPHP1基因表达的MDCK细胞为对照,同法检测敲低靶基因的蛋白,并观察细胞形态.结果 3对sgRNA通过重组真核表达载体,成功转染MDCK细胞.筛选获得1株NPHP1稳定敲除的MDCK细胞,基因测序显示为小片段缺失与移码点突变的复合杂合突变[c.500_551del(p.His167GlnfsTer14)和c.499delC(p.His167ThrfsTer31)].基因测序显示,8个可能脱靶位点与原位点测序一致,排除脱靶情况.CRISPR/Cas9技术构建NPHP1基因敲除的MDCK细胞NPHP1 mRNA表达下降,NPHP1基因编码蛋白nephrocystin-1表达完全缺失;shRNA技术构建NPHP1基因敲低的MDCK细胞nephrocystin-1表达减低.MDCK细胞聚集分布,呈铺路石样改变;两种技术构建的MDCK细胞外形改变类似,略呈长梭形,细胞间隙稍增大.结论 利用CRISPR/Cas9技术成功构建了NPHP1基因稳定敲除的MDCK细胞,将有利于NPHP发病机制的体外研究.
关键词：肾单位肾痨NPHP1基因CRISPR/Cas9技术基因敲除
分类号：R692.9(泌尿科学（泌尿生殖系疾病）)
资助基金：国家自然科学基金(81470913)国家自然科学基金(81670610)
论文发表日期：2020-06-15
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：6( 21-25,115 )
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