胃癌干细胞差异表达基因筛选及其对肿瘤发生能力的调控机制
徐桂华1
董志会2
谭雪怡1
申杰3
1.东莞市滨海湾中心医院精准医学研究重点实验室,广东 东莞 5239002.东莞市滨海湾中心医院精准医学研究重点实验室,广东 东莞 523900;东莞市滨海湾中心医院中心实验室,广东 东莞 5239003.深圳市龙岗区第三人民医院神经内科,广东 深圳 518115
摘要：目的 筛选胃癌干细胞差异表达基因,分析其对胃癌干细胞肿瘤发生能力的调控机制.方法 采用FACSCalibur流式细胞仪分选人胃癌细胞系MKN-45中的CD44+、CD44-细胞,并经CD44+表达率、细胞球集落形成实验、裸鼠成瘤实验证实CD44+胃癌细胞具有干细胞特性.取CD44+、CD44-胃癌细胞,HiSeq4000测序仪测序后筛选差异表达基因,经实时荧光定量PCR法和Westen blotting法证实差异具有统计学意义的仅有细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂1A(CDKN1A).设计CDKN1A siRNA1、siRNA2、siRNA3,其中CDKN1A siRNA2仅抑制CD44+胃癌细胞CDKN1A mRNA表达但不会影响细胞存活率和细胞凋亡率.取CD44+胃癌细胞,分为GAPDH siRNA组、NC siRNA组和CDKN1A siRNA2组,分别使用Lipofectamine2000转染GAPDH siRNA、NC siRNA、CDKN1A siRNA2,采用细胞球集落形成实验检测细胞球集落形成数量,BrdU标记法检测BrdU阳性细胞率,流式细胞术检测细胞周期比例.利用Webgestalt软件预测CD44+胃癌细胞中调控CDKN1A表达的上游微小核糖核酸(miRNA),实时荧光定量PCR法证实CD44+、CD44-胃癌细胞中差异具有统计学意义的仅有miR-20a.取CD44+胃癌细胞,随机分为mimic组、mimic NC组、inhibitor组、inhibitor NC组、空白对照组,分别使用Lipofectamine2000转染miR-20a mimic、miR-20a mimic阴性对照、miR-20a inhibitor、miR-20a inhibitor阴性对照和等量PBS,采用实时荧光定量PCR法检测miR-20a、CDKN1A mRNA表达,Westen blotting法检测CDKNIA蛋白表达,流式细胞术检测细胞周期比例,裸鼠成瘤实验检测其在裸鼠体内的成瘤能力(记录注射后0～24 d的肿瘤体积).结果 与NC siRNA组和GAPDH siRNA组比较,CDKN1A siRNA2组细胞集落形成数量、BrdU阳性细胞率、S期细胞比例均升高而G1期细胞比例降低(P均<0.05).与Control组、mimic NC组、inhibitor NC组比较,mimic组miR-20a表达升高而CDKN1A mRNA及蛋白相对表达量降低,inhibitor组miR-20a表达降低而CDKN1A mRNA及蛋白相对表达量升高(P均<0.05).与Control组、mimic NC组、inhibitor NC组比较,mimic组G1期细胞比例降低而S期细胞比例、15～24 d肿瘤体积均升高,inhibitor组G1期细胞比例升高而S期细胞比例、15～24 d肿瘤体积均降低(P均<0.05).各组 0～12 d肿瘤体积比较差异均无统计学意义(P均>0.05).结论 差异表达基因miR-20a可通过负向靶控CDKN1A表达而调控胃癌干细胞的细胞周期,从而增强其肿瘤发生能力.
关键词：微小核糖核酸20a胃癌干细胞细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂1A细胞周期肿瘤发生能力
分类号：R735.2(消化系肿瘤)
资助基金：广东省医学科学技术研究基金项目(A2023232)
论文发表日期：2025-03-25
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：6( 58-63 )
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