通用表达型T载体的构建与真核基因的快速克隆表达
卢银平
郭涛
祝建芳
刘朝
董继华
1.华中科技大学同济医学院附属协和医院病毒研究室,武汉市,4300222.华中科技大学同济医学院附属协和医院病毒研究室,武汉市,4300223.华中科技大学同济医学院附属协和医院病毒研究室,武汉市,4300224.华中科技大学同济医学院附属协和医院病毒研究室,武汉市,4300225.华中科技大学同济医学院附属协和医院病毒研究室,武汉市,430022
摘要：目的:为简化PCR产物真核表达载体构建步骤,构建真核表达型T载体,并对其特性及表达效率进行分析.方法:限制性内切酶EcoR V酶切真核表达载体pcDNA3,回收线性化质粒片段与dTTP 70℃退火,构成T克隆载体并回收纯化.将增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)和中国旱獭a干扰素基因(cwIFNA5)分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体,转化感受态细菌,挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,病毒保护试验检测中国旱獭a干扰素的生物学活性.结果:外源基因EGFP和cwIFNA5克隆进该载体后可以进行高效表达,基因转染72 h后,荧光显微镜观察到EGFP基因转染细胞荧光阳性率在80%以上,荧光强度高:病毒保护试验表明cwIFNA5转染细胞培养上清干扰素效价高达1∶600.结论:本研究构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外,还可以直接用于基因的高效表达作蛋白质功能分析.
关键词：基因表达表达型T载体基因克隆
资助基金：教育部高等院校博士点基金项目(20070487152)湖北省自然科学基金项目(2008CDB188)
论文发表日期：2009-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：3( 3740-3742 )
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