hnRNP A1的增强型绿色荧光标记及细胞应激定位分析
高星杰1
宋娟2
葛林2
付雪1
孙晓明2
张纬2
何津岩3
姚智4
杨洁5
1.天津医科大学基础医学研究中心 3000702.天津医科大学生化教研室 3000703.天津医科大学生理教研室 3000704.天津医科大学免疫教研室 3000705.天津医科大学基础医学研究中心 300070; 天津医科大学生化教研室 300070
摘要：目的：构建包含有核不均一核糖核蛋白（hnRNP）A1蛋白编码区序列的真核表达质粒pEGFP-C1-hnRNP A1，并对增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的hnRNP A1蛋白进行细胞应激共定位分析。方法提取HeLa细胞总RNA，以针对hnRNPA1-3′非翻译区的特异性片段为反转录引物，反转录出包含hnRNP A1编码区序列的cDNA，并以其为模板，降落PCR法扩增出带EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切位点的目的基因，利用双酶切法分别酶切目的基因片段和线性pEGFP-C1，在T4-DNA连接酶的催化下将两者连接构建成pEGFP-C1-hnRNP A1重组质粒，然后将重组质粒转染入HeLa细胞内，以激光共聚焦荧光显微镜观察EGFP-hnRNP A1的荧光表达情况，Western印迹法检测EGFP与hnRNP A1的融合表达情况，最后进行细胞原位杂交及细胞免疫荧光检测在氧化应激状态下EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA（应激颗粒的标记成分）及DPC1a（加工体的标记蛋白）的应激共定位。结果以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误，激光共聚焦荧光显微镜观察和Western印迹结果检测到绿色荧光融合蛋白的表达；EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA呈现共定位，但与DPC1a无共定位关系。结论重组pEGFP-C1-hnRNP A1质粒成功构建并表达，应激状态下EGFP标记的hnRNP A1参与应激颗粒的构成。
关键词：核糖核蛋白类核不均一绿色荧光蛋白质类膜融合蛋白质类hnRNP A1蛋白pEGFP-C1融合蛋白应激颗粒
分类号：Q591.2(物质代谢及能量代谢)Q784(基因工程（遗传工程）)
资助基金：国家自然科学基金(31100967)国家自然科学基金(31170830)国家自然科学基金(31370749)国家自然科学基金(31125012)
论文发表日期：2014-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：4( 522-525 )
英文信息