利用CRISPR/Cas9n系统构建Asxl2基因敲除的NIH3T3稳定细胞系
方佳萍1
赵秀娟2
齐艳3
王玺2
吴旭东2
娄建石4
1.天津医科大学基础医学院药理学教研室 邮编300070; 天津市和平区小白楼街社区卫生服务中心2.天津医科大学基础医学院细胞生物学系3.天津医科大学眼科医院4.天津医科大学基础医学院药理学教研室 邮编300070
摘要：目的：利用CRISPR/Cas9n系统在NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞系中敲除Asxl2基因。方法设计一对靶向小鼠Asxl2基因第5个外显子的小向导RNA（sgRNA），分别克隆进pX462载体。将测序鉴定正确的重组质粒转染至NIH3T3细胞中，利用有限稀释法得到单细胞，通过培养获得单克隆细胞系。提取单克隆细胞系基因组DNA，ge?notyping PCR扩增出靶位点附近的DNA片段并测序。利用Western blot方法检测细胞株中Asxl2的敲除效果。结果成功构建靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重组质粒。将2个重组质粒共转染NIH3T3细胞，嘌呤霉素筛选后得到亚克隆细胞系，并且经genotyping PCR测序验证得到一株正确的单克隆细胞系。Western blot证实敲除Asxl2后，该NIH3T3细胞系中Asxl2蛋白表达缺失。结论通过这个系统得到了靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重组质粒及稳定敲除Asxl2的NIH3T3细胞系。
关键词：ASXL2CRISPR/Cas9nCRISPR系统表观遗传
分类号：R349.5(基础医学)
资助基金：国家重点基础研究发展计划（973计划）(2014CB910104)天津市高等学校科技发展基金(093-201301)
论文发表日期：2015-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：4( 1104-1107 )
英文信息