分泌型丛生蛋白通过抑制线粒体自噬缓解H2O2诱导的心肌细胞损伤

贺静; 孙晓慧; 杨莉; 乌宇亮

doi:10.11958/20211411

摘要：目的探讨分泌型丛生蛋白(sCLU)对心肌细胞氧化损伤的影响及其机制.方法采用大鼠心肌细胞H9C2.实验1分为Control组(仅更换培养基)和H2O2组(100μmol/L H2O2处理).实验2分为Control组、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1对照空质粒)、pcDNA3.1-sCLU组(转染pcDNA3.1-sCLU过表达质粒)、H2O2组(100μmol/L H2O2处理)、H2O2+pcDNA3.1组(pcDNA3.1对照空质粒转染48 h后加入100μmol/L H2O2处理)、H2O2+pcDNA3.1-sCLU组(pcDNA3.1-sCLU过表达质粒转染48 h后加入100μmol/L H2O2处理).实验3分为DMSO组(加入1％体积分数的DMSO)、Mdivi-1组(10μmol/L的Mdivi-1处理)、H2O2+DMSO组(加入1％体积分数的DMSO处理30 min后加入100μmol/L的H2O2处理)、H2O2+Mdivi-1组(10μmol/L的Mdivi-1处理30 min后加入100μmol/L的H2O2处理)、H2O2+pcDNA3.1-sCLU组(pcDNA3.1-sCLU过表达质粒转染48 h后加入100μmol/L H2O2处理)、H2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1组(pcDNA3.1-sCLU过表达质粒转染48 h后加入10μmol/L的Mdivi-1处理30 min,再加入100μmol/L H2O2处理).采用MTT法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)水平.DFCH-DA荧光探针测定细胞活性氧(ROS)水平.实时定量聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测细胞中sCLU表达,Western blot法检测CLU、PINK1、Parkin和LC3蛋白表达水平.结果 (1)实验1.与Control组比较,H2O2组细胞中sCLU mRNA、细胞培养上清中sCLU蛋白及细胞中CLU蛋白相对表达水平均降低(P<0.01).(2)实验2.与Control组比较,H2O2组细胞活力、SOD水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均降低,细胞凋亡率、ROS水平、MDA水平、PINK1和Parkin蛋白表达水平均升高(P<0.05);与H2O2组比较,H2O2+pcDNA3.1-sCLU组细胞活力、SOD水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均升高,细胞凋亡率、ROS水平、MDA水平、PINK1和Parkin蛋白表达水平均降低(P<0.05).(3)实验3.与DMSO组比较,Mdivi-1组细胞活力与细胞凋亡率差异无统计学意义;H2O2+DMSO组细胞活力下降,细胞凋亡率升高(P<0.05).与H2O2+DMSO组比较,H2O2+Mdivi-1组、H2O2+pcDNA3.1-sCLU组和H2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1组细胞活力均升高,细胞凋亡率均下降(P<0.05).与H2O2+Mdivi-1组比较,H2O2+pcDNA3.1-sCLU组和H2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1组细胞活力差异无统计学意义,细胞凋亡率降低(P<0.05).结论 sCLU对氧化应激条下的心肌细胞具有保护作用,其机制可能与线粒体自噬的抑制有关.