制备人Ⅱ型多巴胺受体cRNA探针检测帕金森病大鼠模型纹状体内Ⅱ型多巴胺受体基因表达的变化
赵焕英
李良
刘延英
刘静
孙晓红
杨慧
1.首都医科大学北京神经科学研究所,北京市神经再生修复重点实验室,北京市,1000542.首都医科大学北京神经科学研究所,北京市神经再生修复重点实验室,北京市,1000543.首都医科大学北京神经科学研究所,北京市神经再生修复重点实验室,北京市,1000544.首都医科大学北京神经科学研究所,北京市神经再生修复重点实验室,北京市,1000545.首都医科大学北京神经科学研究所,北京市神经再生修复重点实验室,北京市,1000546.首都医科大学北京神经科学研究所,北京市神经再生修复重点实验室,北京市,100054
摘要：目的:获得单链、杂交结果稳定的人Ⅱ型多巴胺受体基因正义和反义RNA探针,检测人Ⅱ型多巴胺受体在帕金森病大鼠模型中表达的变化.方法:实验于2002-10/2003-06在首都医科大学神经科学研究所内完成.选出2,6,12周帕金森病大鼠模型60只,每组各20只,用来做原位杂交的组织处理;将已制备的pGEM-T-Easy-D2R质粒载体分别经ClaI、XbaI限制性酶切反应得到线形质粒,再分别以T7和SP6聚合酶制备了人Ⅱ型多巴胺受体基因的反义和正义探针,通过斑点杂交检测探针的浓度;将反义和正义探针分别作等梯度稀释,分别与组织切片杂交,强度洗脱后,观察使对照正义链探针没有杂交信号,而反义探针杂交后也无本底的最适宜浓度,从而降低内缘性其他多巴胺受体亚型的干扰作用;用制备的最适宜浓度探针分别杂交帕金森病大鼠模型2,6,12周的组织切片,杂交后冲洗,免疫检测及呈色,观察帕金森病大鼠模型纹状体中Ⅱ型多巴胺受体表达.结果:①实验标记的人Ⅱ型多巴胺受体探针属cRNA探针,其特点为单链探针,杂交过程不需变性,可合成最可靠的反义链探针,杂交结果稳定,体外转录合成的cRNA探针长度也比较一致,其浓度分别为150,120 mg/L.②将反义和正义探针分别等梯度稀释,分别与组织切片杂交,强度洗脱后,结果证明25 mg/L浓度最适宜,对照正义链探针没有杂交信号,而反义探针杂交后也无本底.③原位杂交证实,反义探针能够与帕金森病大鼠模型纹状体中Ⅱ型多巴胺受体mRNA杂交.用反义探针标记的细胞中可见蓝色颗粒沉积,.左右半球纹状体中标记细胞数在2周时没有变化,帕金森病大鼠损伤侧和健侧Ⅱ型多巴胺受体mRNA表达没有明显变化;6周时,损伤侧较健侧表达明显上调,12周时,损伤侧与健侧表达都下降且没有明显差别.结论:实验获得了人Ⅱ型多巴胺受体基因反义和正义cRNA探针,并得出无本底的最适宜浓度;制备的人Ⅱ型多巴胺受体cRNA探针可以检测帕金森病大鼠模型纹状体内Ⅱ型多巴胺受体基因变化情况,并说明了帕金森病大鼠纹状体Ⅱ型多巴胺受体mRNA表达水平随模型日期增长而发生相应变化.
关键词：帕金森病受体多巴胺/遗传学原位杂交基因RNA信使/生物合成
分类号：R742(神经病学与精神病学)
资助基金：北京市教委科技发展计划(KZ200310025009)北京市自然科学基金(7022005)国家高技术研究发展计划（863计划）(2003AA326010)
论文发表日期：2005-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：4( 25-27 )
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