小鼠Wnt-3a基因真核表达载体的构建及其在cos-7细胞中的表达
张辉1
尹宗生1
张胜权2
陈斌2
王伟1
华兴一1
胡勇1
李光武3
1.安徽医科大学第一附属医院骨科,安徽省合肥市,2300322.安徽医科大学分子生物学教研室,安徽省合肥市,2300323.安徽医科大学神经生物研究所,安徽省合肥市,230032
摘要：目的:克隆小鼠胚脑中Wnt-3a基因片段,构建pSecTag2/Hygro B-Wnt3a真核表达载体,观察其在cos-7细胞中的表达,为基因治疗脊髓损伤提供实验依据.方法:实验于2004-09/2005-03在安徽医科大学分子生物学实验室完成.选取清洁级孕13.5 d的KM小鼠1只,脱颈处死,冰冷条件下迅速取出胚鼠,解剖显微镜下剥离胚脑,在无RNA酶污染的条件下迅速提取胚脑总RNA.利用反转录聚合酶链方法扩增小鼠胚脑Wnt-3a基因片段,将该基因片段克隆入T载体,聚合酶链反应法筛选并测序,双酶切后构建重组真核表达载体pSecTag2/Hygro B-Wnt3a.转染并筛选稳定表达的cos-7细胞,Western blot鉴定重组Wnt-3a蛋白的表达.结果:①反转录聚合酶链反应获得目的基因小鼠Wnt-3a cDNA:自胚鼠脑组织总RNA经反转录聚合酶链反应扩增后,凝胶电泳可见约1.1kb的特异性扩增片段,与预期获得产物大小相符.②pMD18-T/Wnt3a克隆质粒聚合酶链反应初步筛选与测序:测序报告所克隆的Wnt-3a为1 058 bp,通过Blast同源性分析,与GeneBank收录的序列一致,克隆小鼠Wnt-3a基因获得成功.③真核表达载体pSecTag2/Hygro B-Wnt3a的双酶切及测序:随机挑选10个克隆,聚合酶链反应扩增筛选出阳性克隆5个,经XhoⅠ和HindⅢ双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组质粒构建成功.④Western Blot鉴定重组小鼠Wnt-3a蛋白在cos-7细胞中的表达:脂质体转染cos-7后48 h,Western Blot鉴定出在细胞内存在Wnt-3a蛋白的表达,转染pSecTag2/Hygro B-Wnt3a的cos-7细胞裂解液在45KD处出现阳性条带,而培养上清中未能检测到蛋白的表达.结论:小鼠胚脑Wnt-3a基因的真核表达载体pSecTag2/Hygro B-Wnt3a构建成功,转染cos-7细胞后能够表达重组Wnt-3a蛋白.
关键词：Wnt-3a载体克隆序列分析基因表达
分类号：R349.64(基础医学)
资助基金：中国科学院项目（非规范项目）(30571881)安徽省自然科学基金(050430713)
论文发表日期：2005-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：4( 29-31 )
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