具G418抗性NIH3T3细胞饲养层的制备
张梅英
李华
董婉维
杨葳
汪瑛
秦英
王禄增
王太一
1.中国医科大学实验动物部,辽宁省,沈阳市,1100012.中国医科大学实验动物部,辽宁省,沈阳市,1100013.中国医科大学实验动物部,辽宁省,沈阳市,1100014.中国医科大学实验动物部,辽宁省,沈阳市,1100015.中国医科大学实验动物部,辽宁省,沈阳市,1100016.中国医科大学实验动物部,辽宁省,沈阳市,1100017.中国医科大学实验动物部,辽宁省,沈阳市,1100018.中国医科大学实验动物部,辽宁省,沈阳市,110001
摘要：背景:建立具有抗药(新霉素或潮霉素)性的饲养层细胞是转染外源目的基因胚胎干细胞阳性克隆的筛选必备条件.建成的具有抗药性的NIH3T3细胞系可用于胚胎干细胞其他目的基因的筛选.目的:建立具有G418抗性的NIH3T3细胞系,用于转染pTet-on基因的胚胎干细胞阳性细胞克隆筛选的饲养层.设计:细胞培养观察及DNA检测.单位:中国医科大学实验动物部.材料:NIH3T3细胞由中国医科大学细胞生物教研室惠赠,pWL/neo质粒为美国哈佛大学医学院金壮教授惠赠.G418、白血病抑制因子(胚胎干细胞GRO 106 U/mL)、DMEM为GIBCO BRL产品,丝裂霉素-C、DIG标记及检测试剂盒为Roche产品,脂质体为Invitrogen产品,均购自沈阳联星生物技术有限公司.方法:①通过脂质体转染的方法,将含有neo基因的质粒pWL/neo导入NIH3T3细胞中.②将细胞传至25 mL培养瓶中,加入梯度浓度的G418继续培养,通过观察细胞生长及死亡情况测定G418对NIH3T3细胞最小致死量.③将转染的细胞进行传代,挑取单个细胞的克隆至24孔培养板继续进行筛选扩增,选用正常的NIH3T3细胞加入相同剂量的G418的选择性培养基作为筛选的阴性对照.④采用较低的细胞密度铺板,加入含最小致死量G418的DMEM培养基进行再次筛选;同时选用正常的NIH3T3细胞为对照,使用含有最小致死量G418及未加G418的DMEM培养基进行培养,采用光学显微镜对G418抗性NIH3T3细胞进行观察.⑤选用具有G418抗性的NIH3T3细胞和小鼠胚胎成纤维细胞分别作为饲养层细胞进行传代,采用光学显微镜对培养后胚胎干细胞-D3细胞进行观察,并制备细胞DNA,对其进行PCR和southern blot鉴定.主要观察指标:①G418对NIH3T3细胞最小致死量的测定结果.②G418抗性NIH3T3细胞的筛选结果.③G418抗性NIH3T3细胞的生长观察结果.④胚胎干细胞-D3细胞生长观察结果及G418抗性NIH3T3细胞的鉴定.结果:①G418对NIH3T3细胞最小致死量为500mg/L.②经过500mg/LG418压力筛选后,获得了抗G418细胞克隆.③抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异.④饲养层培养的胚胎干细胞呈集落形状生长,边缘光滑,保持未分化的状态.用特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段,Southern blot鉴定结果表明neo基因片段已整合入G418抗性NIH3T3细胞中.结论:成功地培育了G418抗性NIH3T3细胞,生长在G418抗性NIH3T3细胞饲养层上胚胎干细胞细胞基本保持正常胚胎干细胞细胞特征.
关键词：转染饲养层胚胎干细胞抗药性
分类号：R3(基础医学)
资助基金：国家自然科学基金(30070353)
论文发表日期：2006-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：5( 144-147,封三 )
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