人血管生成素1的克隆、序列分析和单酶切法构建毕氏酵母表达载体
马腾1
刘学政1
刘丽波2
范海鹰3
1.辽宁医学院解剖教研室,辽宁省锦州市1210012.中国医科大学神经生物学教研室,辽宁省沈阳市,1100003.本溪市公安局技术一大队,辽宁省本溪市,117000
摘要：目的:从人胎盘中克隆血管生成素1基因,并分析其结构特征,单酶切法构建毕氏酵母表达载体pPlC9K/Ang-1,为进一步研究血管生成素1防治糖尿病视网膜病变的血管渗漏奠定物质基础.方法:实验于2003-11/2004-06在北京大学医学部细胞系完成.提取人胎盘组织总RNA,用反转录聚合酶链式反应技术扩增出血管生成素1基因片段,并将其克隆到PGEM-T Easy载体中进行序列分析,用小牛肠碱性磷酸酶法去除线性化的pPIC9K质粒DNA两端磷酸基,以防止质粒自身环化,再亚克隆到毕氏酵母表达载体pPlC9K中.结果:①经甲醛变性胶电泳鉴定,成功从胎盘组织中提取出总RNA,RNA的完整性和纯度符合进一步的酶反应要求.②胎盘组织总RNA经oligo-dT引物反转录,用人血管生成素1特异一对引物进行聚合酶链反应扩增,10 g/L琼脂糖胶电泳结果显示一条特异片段,大小为1 5kb cDNA片段.③成功构建了PGEM-T/Ang-1载体,Blast序列分析与GenBank中AY121504一致.两者成熟区cDNA的核苷酸和氨基酸同源性分别大于99%和98%,国人血管生成素1基因核苷酸序列的起始密码子ATG,终止密码子为TGA,共1 497个碱基对.④成功构建pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体.结论:从人的胎盘中克降血管生成素1基因无突变,成功构建pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体,满足表达蛋白质的需要.
关键词：血管生成素1逆转录聚合酶链反应克隆分子序列分析
分类号：R3(基础医学)
资助基金：国家自然科学基金(305007)辽宁省科技计划(2003225007)
论文发表日期：2007-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：5( 1041-1044,1048 )
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