细胞色素P450-2J3基因的克隆及其在牛内皮细胞中的表达
闫哲1
李仁立2
汪道文2
1.商丘市第一人民医院心内科,河南省商丘市,4761002.华中科技大学同济医学院附属同济医院综合科,湖北省武汉市,430030
摘要：目的:克隆大鼠CYP2J3基因并构建Pcdna3.1(+)-CYP2J3真核表达载体,检测其在牛内皮细胞中的表达.方法:实验于2004-09/2005-02在同济医院心血管实验室完成.提取大鼠肝脏组织总RNA,通过逆转录反应形成CYP2J3CDNA,采用聚合酶链反应扩增出CYP2J3基因A和B两片段,全长分别是1 228 bp和345 bp.运用重叠延伸聚合酶链反应连接CYP2J3基因A和B两片段,扩增出大鼠CYP2J3基因全长ORF序列.用Kpnl、Notl限制性内切酶位点克隆人pbluescript SK(+)克隆载体,通过限制酶切位点AflⅡ剔除假基因CYP2J3P1,取酶切正确的pbluescript SK(+)-CYP2J3重组质粒进行CYP2J3基因全长测序,检测到不含假基因序列.用Kpnl,Notl将CYP2J3基因克隆入真核表达载体pDNA3.1(+).用脂质体转染牛内皮细胞,免疫印迹技术鉴定其在牛内皮细胞表达.结果:运用聚合酶链反应成功克隆出CYP2J3基因A片段,全长1 228 bp;B片段,全长345 bp,并运用重叠延伸聚合酶链反应获得CYP2J3基因ORF全长序列.将CYP2J3基因ORF全长序列克隆入pbluescript SK(+)克隆载体,通过AflⅡ酶切位点筛选出含有CYP2J3基因的克隆质粒.全长测序CYP2J3基因,测序结果与基因GenBank提交序列完全一致,并成功构建真核表达载体Pcdna3.1(+)-CYP2J3.通过脂质体转染牛内皮细胞,免疫印迹结果显示,转染Pcdna3.1(+)-CYP2J3后的牛内皮细胞能稳定有效表达CYP2J3蛋白.结论:实验成功克隆CYP2J3基因A和B两片段,运用重叠延伸聚合酶链反应获得CYP2J3基因,并成功构建Pcdna3.1(+)-CYP2J3真核表达载体,为CYP2J3基因的功能研究和相关疾病的研究提供了可行的理想工具.
关键词：基因克隆聚合酶链反应转染基因表达
分类号：R3(基础医学)
论文发表日期：2007-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：4( 1049-1052 )
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