Ⅳ型胶原黏附法分选表皮干细胞
刘坡1
祁少海2
舒斌2
谢举临2
徐盈斌2
黄勇2
刘旭盛2
1.中山大学附属第一医院烧伤科,广东省广州市,510080;东莞市塘厦医院外一科,广东省东莞市,5237102.中山大学附属第一医院烧伤科,广东省广州市,510080
摘要：目的:评估Ⅳ型胶原黏附法分选表皮干细胞的分选效果及对细胞生物学特性的影响.方法:实验于2004-11/2005-05在中山大学附属第一医院外科实验室完成.选取中山大学附属第一医院外科门诊包皮环切手术患者的皮肤标本5份(患者知情同意),进行表皮细胞的分离培养.取培养的二三代表皮细胞,消化后加入铺有100 mg/L Ⅳ型胶原的培养瓶中分选.取分选细胞悬液于培养箱中过夜培养,第2天取出爬片,磷酸缓冲液冲洗3 min×2次,去除残留培养液,4%多聚甲醛室温下固定10 min,磷酸缓冲液冲洗3 min×2次,以含0.1%Triton-100的3%山羊血清封闭、透膜20 min,滴加稀释好的角蛋白K19/β1整合素抗体进行双标,4 ℃过夜孵育,磷酸缓冲液冲洗3 min×2次,加入配置好的双标用二抗,37 ℃下孵育20 min,磷酸缓冲液冲洗3 min×2次,加入5 mg/L的,Hochest33258,标记细胞核,37 ℃下孵育5 min,磷酸缓冲液冲洗3 min×2次,滴加含40%甘油的碳酸氢钠缓冲液,盖玻片封片,以上步骤均在暗室中操作,同时以磷酸缓冲液代替一抗作为阴性对照.激光共聚焦显微镜下观察,拍照.同时表达角蛋白K19、β1整合素认为是表皮干细胞.分别取分选前及筛选后细胞各4×106个,检测表皮干细胞(α6briCD71dim细胞)、短暂扩增细胞(α6briCD71bri细胞)及终末分化细胞(α6dim细胞)的百分率及分选前后的细胞周期.结果:①分选后细胞体积小,均匀一致,核浆比例大,免疫荧光检测同时表达K19、β1整合素.②与分选前细胞比较,分选后细胞中表皮干细胞α6briCD71dim细胞、短暂扩增细胞α6briCD71bri细胞的百分率明显增高,差异显著[(9.41±.0.31)%,(38.74±1.09)%;(43.66±1.12)%,(48.92±2.49)%,P＜0.01].③与分选前细胞比较,分选后细胞G0/G1期所占比例明显增高,差异显著[(80.80±1.69)%,(94.37±1.32)%,P＜0.01].提示分选后细胞处于相对静止状态的表皮干细胞所占比例高.结论:Ⅳ型胶原黏附分选出的细胞含有高纯度的表皮干细胞,此分选方法对细胞活力无明显影响.能够为组织工程皮肤构建提供理想的种子细胞.
关键词：表皮干细胞分选Ⅳ型胶原
分类号：R3(基础医学)
资助基金：广东省自然科学基金(31685)广东省科技厅科技项目(2004B35O01002)广东省广州市科技局资助项目(2006Z3-E5131)
论文发表日期：2007-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：5( 1201-1204,1401 )
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