建立猪血管内皮细胞对人血清适应的模型及其评估

李孟彬; 王为忠; 李开宗; 张洪伟; 季刚; 沈新

doi:10.3321/j.issn:1673-8225.2007.10.014

摘要：目的:观察人免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和正常人AB型血清诱导猪血管内皮细胞适应状态的效果.方法:实验于2002-05/2003-02在解放军第四军医大学分子生物学实验室完成.①正常人AB型血清和猪血清制备:取健康AB血型成年人血,每次50 mL,置于干燥管内,垂直静置6· h,3 000 r/min离心10 min,取上清.操作4℃条件下进行,以保证补体的活性.获得血清于-20℃保存备用,用前0.22 μm滤膜过滤除菌.猪血清制备同上.②猪血管内皮细胞培养、纯化及鉴定:取体质量3 kg实验用乳猪,自左侧髂总动脉向心侧插入大隐静脉导管20 cm,注射肝素500 U后持续滴注含肝素抗生素盐水(肝素1×105 U/L,青霉素4×107 U/L),取腹主动脉和胸主动脉,以4℃含肝素抗生素盐水冲洗管腔和外膜后注入37℃预热的10 g/L Ⅰ型胶原酶,消化5 min后收集消化液,以1 000 r/min离心5 min,收集细胞放于CO2孵箱内培养并传代,第3代以后不再使用抗生素.在光学显微镜下观察细胞生长形态,进行培养细胞类型的鉴定.③正常人血清对猪血管内皮细胞溶解试验:将猪血管内皮细胞制成浓度5×106 L-1的细胞悬液,接种于96孔培养板,每孔200 μL,培养至第4天细胞基本铺满培养板底部后加入含正常人AB型血清的培养液,终浓度分别为5%、10%、25%、40%,以相应浓度猪血清为对照,每组各取3孔.放人37℃孵箱内孵育2 h后以四唑盐比色试验测各孔的吸光度值.④猪血管内皮细胞对人血清适应模型的建立及评估:培养猪血管内皮细胞,分别以免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和低浓度正常人AB型血清诱导猪血管内皮细胞6 d,以四唑盐比色法检测细胞存活率,并以免疫组化方法检测其血红素氧合酶1表达的情况.结果:①接种细胞形态呈圆形、三角形或短梭形,胞体丰满、胞浆均匀、核仁清晰.部分细胞呈团块样,大部分细胞为单细胞分布,其间混杂有少许血细胞,说明培养细胞为血管内皮细胞,无明显杂细胞污染.②在25%的正常人AB型血清作用下,猪血管内皮细胞的存活率为(71±22)%.与对照组相比较,100 mg/L免疫球蛋白M和5%、10%正常人AB型血清诱导猪血管内皮细胞存活率分别为(81±31)%,(93±25)%,(90±42)%.③诱导后猪血管内皮细胞胞浆内血红素氧合酶1的表达明显增加.结论:100 mg/L免疫球蛋白M和正常人AB型血清能够诱导猪血管内皮细胞的适应,后者效果更为明显.