成人自体血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞的生物学特性分析

张媛; 陈立梅; 张雷; 倪红霞

doi:10.3321/j.issn:1673-8225.2007.28.019

摘要：目的:为避免种子细胞培养过程中应用异体或异种血清的排斥及伦理问题,制备成人自体血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞,观察其增殖及生长特征.方法:实验于2005-01/2006-01在北华大学医学院细胞生物实验室完成.①细胞来源:选取北华大学医学院附属医院收治的行骨髓干细胞保健治疗的成年志愿者3名,25～30岁,对本实验均知情同意.②实验方法:空腹无菌采集志愿者外周静脉血40 mL,4℃静置4 h,37℃静置4 h,500 g离心30 min,吸取上清,即自体血清.从骨髓血中提取间充质干细胞,利用DMEM/F12培养基添加自体血清进行黏附培养和扩增.原代记为P1,按1:3进行传代接种,第2代记为P2,以此类推.每次传代培养的细胞接种密度严格控制与原代培养接种密度相同的水平.③实验评估:倒置光学显微镜下观察骨髓间充质干细胞生长和形态变化,计数和MTT法观察原代和传代培养的增殖及生长特征,免疫组化法分析骨髓间充质干细胞纯度.结果:①原代及传代培养的成人骨髓间充质干细胞的光镜观察:原代培养24 h后可见贴壁细胞,部分细胞有伪足伸展,第3天换液时有散在克隆生长,第5天呈克隆式增殖,10～12 d可达90%细胞融合,基本铺满孔底面,呈骨髓间充质干细胞特征性的旋涡状生长,排列有方向性,旋涡中心细胞呈多层分布,细胞界限不清,细胞形态多呈梭形.传代细胞的生长较原代快,4 h内即发现有贴壁细胞,24 h内完全贴壁并伸展,第6～8天即可达到80%以上融合.②成人骨髓间充质干细胞的生长曲线分析:原代接种后2～6 d为生长潜伏期,第7天开始形成大小不一的多个细胞克隆,至第9天细胞克隆进一步扩大,细胞数目呈指数级递增,为对数增殖期;第10～12天细胞生长进入平台期,原代培养结束.传至5代内的细胞生长旺盛,生长特性基本与第1代一致.③成人骨髓间充质干细胞免疫组化鉴定结果:P0、P1、P3、P5代细胞CD34染色呈阴性,而CD105染色阳性细胞在95%以上.结论:以自体血清体外扩增培养的骨髓间充质干细胞纯度高、增殖活性强,且至少在5代内生长旺盛并维持其生物特性.