受强力霉素调控的永生化骨骺干细胞株的建立
李明辉
郭风劲
张树威
宋登新
王江
易磊
1.华中科技大学同济医学院同济医院矫形外科,湖北省武汉市,4300302.华中科技大学同济医学院同济医院矫形外科,湖北省武汉市,4300303.华中科技大学同济医学院同济医院矫形外科,湖北省武汉市,4300304.华中科技大学同济医学院同济医院矫形外科,湖北省武汉市,4300305.华中科技大学同济医学院同济医院矫形外科,湖北省武汉市,4300306.华中科技大学同济医学院同济医院矫形外科,湖北省武汉市,430030
摘要：目的:建立受强力霉素调控高表达外源基因的真核表达体系-永生化骨骺干细胞株,为调控甲状旁腺相关肽的不同片断在骨骺干细胞中的表达打下基础.方法:实验于2006-09/2007-03在同济医学院矫形外科实验室完成.①实验材料:SD大鼠的乳鼠由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供,雄鼠4只,雌鼠6只.②实验方法:取SD大鼠的乳鼠10只,显微镜下选取La Croix环处的软骨及软骨前体细胞(骨骺干细胞),采用磁性细胞分选的方法,分离出原代骨骺干细胞,并用PCMVSV40质粒将其永生化.用脂质体介导法将pTet-on质粒转染已永生化的骨骺干细胞,通过G418筛选并经有限稀释法进行单克隆化,得到稳定转染的抗性克隆并将其分别扩增培养.将pTRE2hyg-IUC质粒瞬时转染扩增后的单克隆细胞,加入终浓度为1 mg/L的强力霉素诱导剂培养,48 h后逐一检测每个细胞株的荧光素酶表达活性,逐一筛选强力霉素调控高表达外源基因的永生化骨骺干细胞株.③实验评估:将挑选出的第23号克隆扩增培养,加入0.01,0.1,0.5,1,5mg/L强力霉素进行诱导培养,并设置3组对照,一组为空白对照(蒸馏水),一组为未转染Tet-on系统的骨骺干细胞(均加入1 mg/L 0.1 mg/强力霉素诱导),另一组为转染后的骨骺干细胞不加入强力霉素诱导.观察强力霉素对骨骺干细胞的最优诱导质量浓度. 结果:第23号克隆的细胞经诱导后荧光素酶的表达活性为85 790,而非诱导状态下该细胞株的活性为437,诱导后的活性增加196.3倍.强力霉素质量浓度梯度实验提示,强力霉素的最优诱导质量浓度是1 mg/L左右,质量浓度过高可导致细胞死亡,过低时诱导效率降低.结论:永生化骨骺干细胞株可用于真核调控高表达,为研究甲状旁腺相关肽的不同功能片断与骨骺干细胞的分化机制的关系打下了基础.
关键词：基因表达调控干细胞强力霉素
分类号：R394.2(医学遗传学)
资助基金：国家自然科学基金(30571872)
论文发表日期：2007-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：4( 6534-6537 )
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