RNA干扰选择性下调血管平滑肌细胞结缔组织生长因子的表达
闵新文1
郎明健2
杨汉东1
郭敏3
李健3
1.郧阳医学院附属东风医院心内科,湖北省十堰市,4420082.郧阳医学院附属东风医院心内科,湖北省十堰市,442008;华中科技大学同济医学院协和医院心内科,湖北省武汉市,4300223.华中科技大学同济医学院协和医院心内科,湖北省武汉市,430022
摘要：目的:从血管平滑肌细胞结缔组织生长因子的基础分泌及转化生长因子β1对其分泌的诱导作用入手,进一步观察并验证RNA干扰技术靶向抑制结缔组织生长因子对下游纤维化因子的影响.方法:实验于2006-03/2007-05在武汉协和医院心血管病研究所实验室完成.①实验材料:健康雄性成年SD大鼠,体质量150～180 g.②实验方法及分组:分离培养成年大鼠血管平滑肌细胞,以5μg/L终浓度转化生长因子β1对培养的血管平滑肌细胞进行诱导,再通过脂质体法将靶向大鼠结缔组织生长因子的shRNA干扰质粒转染入血管平滑肌细胞,200 mg/L终浓度的G418筛选出稳定转染细胞株后培养增殖进入后续实验.将实验分为5组,分别为对照组,不给与任何干预措施;转化生长因子β1刺激组,在培养的血管平滑肌细胞培养液中加入转化生长因子β1(5μg/L终浓度)刺激诱导24 h;HK阴性质粒对照组,血管平滑肌细胞常规培养3～5代后转染HK阴性质粒继续培养48 h;RNA干扰组,先以转化生长因子β1(5μg/L终浓度)诱导刺激血管平滑肌细胞24 h后再转染干扰质粒继续培养48 h;单纯转染试剂组,细胞常规培养3～5代后仅加入lipo2000转染试剂.③实验评估:通过逆转录-聚合酶链反应和(或)蛋白免疫印迹技术进一步检测各组心肌细胞结缔组织生长因子、纤维连接蛋白mRNA及蛋白的表达.结果:①组织块贴附法培养的原代血管平滑肌细胞,可见大量细胞紧密排列成长梭形.②倒置荧光显微镜下观察,脂质体lipo2000转染血管平滑肌细胞瞬时转染效率仅有大约30%左右;而通过加入G418进行稳定转染后,几乎所有细胞均可被激发出亮绿色荧光,转染效率可达95%以上.③对照组结缔组织生长因子、纤维连接蛋白均有低水平的基础分泌,在予以转化生长因子β1诱导后表达显著升高(P＜0.01);而在靶向特异性RNA干扰后,与转化生长因子β1刺激组比较,结缔组织生长因子及纤维连接蛋白的表达均被显著抑制(P＜0.01);并且纤维化因子纤维连接蛋白及胶原的表达与促纤维化因子结缔组织生长因子的表达有显著相关性.结论:血管平滑肌细胞可自主分泌结缔组织生长因子及细胞外基质成分;而通过RNA于扰靶向抑制结缔组织生长因子后可阻抑血管平滑肌细胞分泌下游纤维化因子.提示血管平滑肌细胞可主动参与心血管重塑及纤维化,而RNA干扰靶向沉默结缔组织生长因子基因的表达可以有效干预纤维化过程.
关键词：血管平滑肌细胞结缔组织生长因子RNA干扰纤维化
分类号：R329.52(人体形态学)
资助基金：湖北省教育厅科学技术研究项目(D200624006)
论文发表日期：2007-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：5( 9842-9846 )
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