短发夹RNA干扰c-myc重组腺病毒的构建
王栋琪
刘淼
王民
张银刚
1.西安交通大学医学院第一附属医院骨科,陕西省西安市,7100612.西安交通大学医学院第一附属医院骨科,陕西省西安市,7100613.西安交通大学医学院第一附属医院骨科,陕西省西安市,7100614.西安交通大学医学院第一附属医院骨科,陕西省西安市,710061
摘要：背景:RNA干扰已被多次证实足一种特异、高效、经济的使基因表达受抑的技术手段.目的:以短发卡RNA腺病毒表达载体为介导,构建介导shRNA-c-myc复制缺陷型重组腺病毒.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-09/2007-09在环境与疾病相关基因教育部重点实验室完成.材料:人骨肉瘤细胞系OS-9901由解放军第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所范清宇教授惠赠.方法:设计有短发夹RNA结构的3对单链寡核苷酸(ss oligo),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligo)插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后经阳离子脂质体介导入人骨肉瘤细胞系OS-9901,通过反转录-聚合酶链反应方法筛选对c-myc沉默效果最佳穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组,筛选出正确重组子,用293A细胞包装出表达c-myc-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒.主要观察指标:①观察细胞病变效应.②通过50%组织培养感染剂量测定病毒滴度.结果:电泳验证后的dsoligo插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序结果提示所构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确.对c-myc沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,经Pac Ⅰ酶切线性化后同源重组后成功构建了介导c-myc-shRNA复制缺陷型重组腺病毒.3 d开始出现细胞病变效心,6d更加明显,测定证实病毒滴度为103.8/0.1 mL.结论:成功构建介导shRNA.c-myc复制缺陷型重组腺病毒.
关键词：腺病毒科RNA干扰基因沉默组织构建
分类号：R649.65(创伤外科学)
论文发表日期：2008-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：5( 6442-6446 )
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