大鼠蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因靶向RNA干扰重组腺病毒的构建
卢斌1
吴鸿1
蔡在龙2
邹大进1
1.解放军第二军医大学长海医院,内分泌科,上海市,2004332.解放军第二军医大学长海医院,中心实验室,上海市,200433
摘要：背景:研究者们早已发现蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase,PTP1B)可负性调节胰岛素信号转导,但目前制约PTP1B功能研究的重要环节是缺乏有效的工具.目的:拟构建PTP1B基因靶向RNA干扰重组腺病毒.设计、时间及地点:体外细胞学基因转染实验,于2007-05/12在解放军第二军医大学长海医院中心实验室完成.材料:293细胞由中科院上海细胞研究所提供,真核表达质粒psiRNA-PTP1B由上海吉凯生物公司合成,AdEasy-1菌、穿梭载体pAdTrack、大肠杆菌DH5α由本室保存,重组腺病毒PCR鉴定引物由上海生工生物公司设计合成.方法:由生物公司合成针对大鼠PTP1B mRNA的特异性siRNA真核表达质粒psiRNA-PTP1B,双酶切得到siRNA-PTP1B表达片段,插入pAdTrack载体上,获得转移质粒pAdTrack-siRNA-PTP1B.后者经线性化后,转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183进行同源重组,PacⅠ酶切鉴定,筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-siRNA-PTP1B,酶切线性化后转染293细胞包装成重组病毒颗粒.通过反复感染扩增病毒,采用氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒. 主要观察指标:荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,鉴定重组腺病毒穿梭载体及重组腺病毒是否构建成功.结果:PacⅠ酶切鉴定证实重组腺病毒质粒pAd-siRNA-PTP1B构建成功,转染293细胞后有绿色荧光蛋白表达.PCR鉴定表明重组腺病毒中含有siRNA-PTP1B片断,成功构建了携带PTP1B干扰RNA的重组腺病毒Ad-siRNA-PTP1B,293细胞扩增纯化后,获得约3.6×109 efu/mL滴度的重组腺病毒.结论:应用AdEasy-1系统可以高效快速制备表达PTP1B干扰RNA的重组腺病毒.
关键词：蛋白酪氨酸磷酸酶1BRNA干扰腺病毒
分类号：R392(医学免疫学)
论文发表日期：2008-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：4( 7302-7305 )
英文信息