细菌内重组法快速构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体
陈丽1
陈滨2
宋艳斌3
1.苏北人民医院放化疗科,江苏省扬州市,2250012.南方医科大学南方医院创伤骨科,广东省广州市,5105153.南方医科大学基因工程研究所,广东省广州市,510515
摘要：背景:腺病毒载体具有在哺乳动物及其多种细胞基因转移和蛋白表达的高效性,目前以细菌内重组法构建病毒载体成为常用方法.目的:观察以细菌内重组法构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体的可行性.设计、时间及地点:基因转染病毒载体的单一样本实验,于2007-10/2008-02在中山大学分子生物实验室完成.材料:合成血管内皮生长因子165基因的引物合成和序列测定由上海生工公司提供.pDNR-1r质粒(已含有绿色荧光蛋白基因)、pint.AV.spaT质粒、pint.B.B质粒均购自广州拓普基因技术公司.方法:通过动态模板PCR基因合成法合成的血管内皮生长因子165基因克隆入pMD18-T载体获得pMD18-T-VEGF165.将pMD18-T-VEGF165和pDNR经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,构建pDNR-VEGF165载体,酶切鉴定后,pDNR-VEGF165与pint.AV1.spat共转化BNN菌株的感受态细胞,构建pint,AV1.spat.VEGF165腺病毒表达载体,将线性化的pint.AV1.SpaT-VEGF165和pint.B.B转染293细胞.主要观察指标:以DNA测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的感染效率.结果:重组质粒用EcoR Ⅰ酶切后,切成2条片段,大小约为1 kb和6.9 kb,实际的酶切分析结果与理论分析相符,证明转化子中的重组质粒为Cre-LoxP系统介导的含有血管内皮生长因子165基因的重组质粒.荧光显微镜下,8 h后即可见部分细胞发出荧光,24 h发荧光的细胞数及强度达到高峰,转染率超过80%.线性化的pint.AV1.SpaT-VEGF165和pint.B.B共转染293细胞,12-14 d后会出现细胞病变效应.分别提取病变293细胞、正常293细胞的DNA,PCR后,1%琼脂糖凝胶电泳,病变的293细胞在约500 bp处出现条带.结论:以细菌内重组法获得了含有成熟血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒.
关键词：腺病毒载体血管内皮生长因子165构建
分类号：R392.114(医学免疫学)
资助基金：广东省自然科学基金(07300247)
论文发表日期：2009-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：4( 6505-6508 )
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