人BIGH3基因克隆表达对兔角膜基质细胞黏附和迁移的影响
葛红岩1
石妍1
杨帆1
张毅1
刘平1
刘含若2
1.哈尔滨医科大学附属第一医院眼科医院,黑龙江省哈尔滨市,1500012.University of East Anglia, Norwich NR4 England
摘要：背景:BIGH3蛋白位于角膜上皮和基质层,在基质层高表达,先前研究已经发现BIGH3蛋白能促进角膜上皮创伤愈合,为此进一步探讨其对角膜基质创伤愈合的影响.目的:构建人BIGH3基因的原核表达载体,观察其对角膜细胞与细胞外基质黏附和迁移的作用.方法:PCR扩增BIGH3基因的ORF阅读框,并通过Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ插入到原核表达载体pET32a(+)中.经PCR、酶切和序列测定方法鉴定重组质粒.将重组质粒转入BL21(DE3)表达,IPTG诱导表达人BIGH3融合蛋白,并进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测分析:以Ni-NTA树脂对蛋白纯化与复性,作用于体外培养的兔角膜细胞,用MTT法分析其对细胞与细胞外基质黏附的影响,采用改良的Boyden微孔膜双槽法观察BIGH3蛋白对角膜细胞迁移的影响.结果与结论:重组质粒经PCR、酶切与DNA测序证实插入了pET32a(+)载体中.通过IPTG诱导,成功的表达融合蛋白在包涵体中,经SDS-PAGE电泳分析,出现了一条新生的蛋白条带,Western blot也证实了该蛋白具有与BIGH3抗体特异性的结合能力.MTT法和Boyden微孔膜双槽法分别证明所表达的BIGH3融合蛋白可促兔角膜细胞黏附和迁移.成功构建了人BIGH3重组融合蛋白表达质粒,纯化了该基因的原核表达产物,并通过重组融合蛋白BIGH3能促进兔角膜细胞与细胞外基质黏附及迁移,而验证了重组BIGH3蛋白的活性.
关键词：BIGH3基因角膜细胞黏附迁移组织构建
分类号：R318(医用一般科学)
资助基金：黑龙江省科技攻关计划(GC08C416)哈医大一院院基金(B08-004;11551267)
论文发表日期：2010-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：5( 9361-9365 )
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