大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定
王萍
刘成
方岩
杨凯
田学愎
田玉科
1.华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学研究室,湖北省武汉市,4300302.华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学研究室,湖北省武汉市,4300303.华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学研究室,湖北省武汉市,4300304.华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学研究室,湖北省武汉市,4300305.华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学研究室,湖北省武汉市,4300306.华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学研究室,湖北省武汉市,430030
摘要：背景:最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达.目的:构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率.方法:选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.将重组载体与pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体通过lipofectamineTM 2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩.采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度.将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96 h提取细胞总蛋白,采用Western blot检测NG2的表达.结果与结论:经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi.包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011 TU/L.Western blot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%(P < 0.05).结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因.
关键词：硫酸软骨素蛋白多糖RNA干扰慢病毒感染细胞
分类号：R318(医用一般科学)
资助基金：国家自然科学基金(30872441)
论文发表日期：2011-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：4( 2735-2738 )
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