肺表面活性物质相关蛋白C原核表达载体的构建、表达及纯化
王静
杜江
周细中
刘茹
沈蔚
王斌
1.南方医科大学珠江医院儿科,广东省广州市,5102822.南方医科大学珠江医院儿科,广东省广州市,5102823.南方医科大学珠江医院儿科,广东省广州市,5102824.南方医科大学珠江医院儿科,广东省广州市,5102825.南方医科大学珠江医院儿科,广东省广州市,5102826.南方医科大学珠江医院儿科,广东省广州市,510282
摘要：背景:研究表明肺表面活性物质蛋白基因缺陷导致肺表面活性物质蛋白的结构发生变化.早期检测肺表面活性物质的含量对于预测肺部疾病的发生意义重大.目的:克隆人肺表面活性物质相关蛋白C(surfactant associated protein C,SP-C)基因,构建原核表达载体PET-28a/SP-C,并纯化SP-C 蛋白.方法:提取正常人肺组织总RNA,RT-PCR 技术获得SP-C cDNA 序列,纯化后的SP-C 基因插入至中间载体PMD-18T,得到重组质粒PMD-18T-SP-C,重组质粒经过Bam HⅠ和Hind Ⅲ双酶切后纯化回收得到具有黏性末端的SP-C cDNA,将质粒PET-28a 同样经过双酶切后纯化回收得到与SP-C cDNA 具有相同黏性末端的质粒片段,将具有黏性末端的SP-CcDNA 与PET-28a 定向连接后得到重组质粒PET-28a/SP-C.然后将鉴定正确的PET-28a/SP-C 重组质粒转入BL21 中诱导表达.结果与结论:酶切鉴定及核苷酸序列测序证实扩增的SP-C cDNA 及其重组质粒经过Bam HⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定后,在5 000~7 500 bp 和250~1 000 bp 处可检测到2 条条带.核苷酸序列测序结果证实,质粒中插入基因长597 bp,为一开放阅读框架,与GeneBank 中公布的人SP-C cDNA 序列相符.Western-blot 检测结果显示,纯化后的SP-C 蛋白在相对分子质量约27 000 处出现1 条新生条带,与预期的大小一致.结果证实,实验成功克隆人SP-C 基因并插入至质粒PET-28a中,构建了PET-28a/SP-C 重组质粒,将其体外转化至BL21 后可以表达SP-C 蛋白.
关键词：肺表面活性物质相关蛋白C原核表达载体克隆转化组织构建
分类号：R318(医用一般科学)
论文发表日期：2012-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：5( 2699-2703 )
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