pIRES 2-BDNF-VEGF 165真核表达载体的构建与鉴定
栗炳南
李卫东
林俊堂
丰慧根
1.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,4530032.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,4530033.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,4530034.新乡医学院生命科学技术学院,河南省新乡市,453003
摘要：背景：人脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor ， BDNF)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165，VEGF 165)在细胞分化过程中有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患，利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。<br> 目的：构建双基因共表达载体pIRES 2-BDNF-VEGF 165并对其进行鉴定。<br> 方法：采用PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人脑源性神经营养因子基因，然后将人脑源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES 2-EGFP多克隆位点构建为pIRES 2-BDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES 2-VEGF 165-EGFP质粒中获取，接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换 EGFP 的方式插入pIRES 2-BDNF-EGFP中，最后构建成为含有即内部核糖体进入位点的pIRES 2-BDNF-VEGF 165双基因共表达载体。通过双酶切和 DNA测序方法对其鉴定，将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞，利用 RT-PCR 与Western-blot 方法检测双基因的表达。<br> 结果与结论：DNA测序显示，提取的人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致，片段长度分别为744 bp和576 bp。构建的pIRES 2-BDNF-VEGF 165双基因共表达载体经Eco RⅠ/Bam HⅠ切出BDNF条带，经BDNF/NotⅠ双酶切后可见 IRES-VEGF 165基因片段，经 Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后可见BDNF-IRES-VEGF165基因片段。RT-PCR 与Western-blot 方法检测显示，此载体转染后，HEK293细胞均能表达人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。结果证实，实验成功构建了人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体。
关键词：组织构建组织构建基础实验脑源性神经营养因子血管内皮生长因子165真核双表达载体内部核糖体进入位点转染双PCR省级基金
分类号：R318(医用一般科学)
资助基金：实验由新乡医学院重点领域招标课题(ZD2011-16)河南省教育厅科学技术研究重点项目(13A180850)the Tender Subject of Key Research Areas of Xinxiang Medical Uuniversity in 2011, (No. ZD2011-16)Key Projects in Scientific Research of Henan Provincial Education Department, (No.13A180850)
论文发表日期：2013-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：10( 8719-8728 )
英文信息