构建含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体
张海
蒋正方
刘阳
张波
吴贵强
曾令勇
1.绵阳市第三人民医院神经外科,四川省绵阳市,6210002.绵阳市第三人民医院神经外科,四川省绵阳市,6210003.绵阳市第三人民医院神经外科,四川省绵阳市,6210004.绵阳市第三人民医院神经外科,四川省绵阳市,6210005.绵阳市第三人民医院神经外科,四川省绵阳市,6210006.绵阳市第三人民医院神经外科,四川省绵阳市,621000
摘要：背景：腺病毒的表达时间有限，会限制目的基因的表达时间和表达量，不利于实验的持续进行，故文章选择慢病毒作为载体，与目的基因大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因片段进行基因重组。<br> 目的：探讨构建含有大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体的方法。<br> 方法：根据GenBank中大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体序列(NM 145681.1)，设计出该基因的特异性引物Trail-AgeⅠ-F和Trail-AgeⅠ-R，用PCR法从大鼠cDNA文库中扩增出目的基因，AgeⅠ酶切将该基因克隆入真核表达载体GV218中，产生目的重组质粒，用脂质体 Lipofeetamine 2000包裹构建的重组质粒和辅助包装载体，3个质粒共同转染293T细胞，产生含有表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白的慢病毒颗粒，收集病毒进行滴度鉴定，收集细胞提取蛋白进行基因表达情况的检测。<br> 结果与结论：筛选出的克隆阳性菌测序获得肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因，全长861 bp，与GenBank中发表的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体核苷酸序列完全一致。包装后的病毒LV-mTrail在转染2 d后收集病毒液，经PCR和Western blot方法鉴定，从基因和蛋白的层面均证实携带有目的基因肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因。孔稀释法及实时荧光定量PCR病毒滴度测定法测定结果为2×109 TU/mL。提示大肠杆菌同源重组法能有效和方便地构建出含有肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒载体。
关键词：组织构建组织工程肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体重组质粒PCRWestern blot
分类号：R318(医用一般科学)
论文发表日期：2014-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：6( 265-270 )
英文信息